脐带血间充质干细胞诱导分化为类许旺细胞修复大鼠坐骨神经损伤的实验研究

摘要

背景：周围神经缺损损伤在外科创伤中较为常见，其修复和功能重建一直是临床上面临的一大难题。在周围神经缺损损伤治疗中较为经典的方法是自体神经移植，尽管结果较为理想，但会造成供体神经区域的功能缺失，所以在临床上无法推广。因此，寻找新的神经来源来代替自体神经引起了较多关注。近年来，组织工程的发展为我们提供了新的方法。许旺细胞（SCs）是周围神经主要的功能细胞，但是自体来源的SCs在取材方面较为困难，且在体外培养方面也存在困难,异体来源的SCs则存在免疫排斥反应的问题，这些都限制了它们在临床上的应用。人脐血间充质干细胞(Human Umbilical Cord Blood Mesenchymal Stem Cells,HUCBMSCs)在分离、培养、扩增等环节的成功,以及成功的诱导分化为类SCs,为组织工程修复周围神经缺损损伤的种子细胞提供了一种新的选择。
　　目的：评价将HUCBMSCs来源的类SCs作为种子细胞，修复大鼠坐骨神经15㎜缺损损伤的效果，为HUCBMSCs在临床上治疗周围神经损伤提供必要的实验依据。
　　方法：⑴无菌条件下，收集足月产、正常胎儿的脐带血，应用肝素抗凝，使用6％高分子量羟乙基淀粉沉降红细胞，后应用人淋巴细胞分离液分离出脐血中单个核细胞，再应用Mesencult?培养基对分离出的单个核细胞进行培养、纯化以及扩增，从而获得MSCs，并通过流式细胞仪对细胞表型进行鉴定；⑵依次应用含β-ME+bFGF、RA、Forskolin+bFGF+PDGF-BB+NGF+Heregulin的诱导液将脐带血MSCs定向诱导分化为类SCs,并通过免疫细胞化学法，鉴定诱导后细胞的神经胶质细胞标志物S100b、GFAP、P75；⑶应用-196℃液氮反复冻融振荡洗涤的方法对异体神经脱细胞处理，制备去细胞坐骨神经基膜管，修剪长度为15mm,调整类SCs密度为1×107/mL后，使用微量注射器将细胞注入去细胞基膜管中，制备成组织工程神经；⑷30只SD大鼠随机分为3组,每组10只,A组:将类SCs复合去细胞神经基膜管后桥接15㎜坐骨神经缺损；B组:仅用去细胞神经基膜管桥接15㎜神经损伤；C组:坐骨神经切下15㎜后原位缝合。8周后,进行大鼠大体观察、坐骨神经功能指数测定、腓肠肌湿重测定、神经电生理功能检测、组织学染色观察等检查对神经修复情况进行评价。
　　结果：①分离培养出的细胞高表达CD44、CD73，低表达或不表达CD34；②诱导后类SCs几乎都表达神经胶质细胞标志物 S100b、GFAP和P75；③通过8周的动物实验观察，脐带血MSCs来源的类SCs复合神经支架（A组）在神经再生及功能恢复上效果良好，优于单纯神经支架组（B组），较自体神经移植组（C组）差，差异显著(P<0.05)。
　　结论：⑴人脐带血间MSCs来源的类SCs能够促进大鼠15mm坐骨神经损伤的修复。⑵人脐带血间MSCs来源的类SCs能够作为组织工程神经支架种子细胞的来源,且为周围神经缺损损伤修复提供了一种新的方法。

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引言

材料和仪器

1.脐带血来源

2.主要仪器和试剂

实验方法

1脐带血间充质干细胞分离培养及鉴定

2 脐带血MSCs定向诱导分化为类SCs及鉴定

3组织工程神经的制备及检测

4动物实验

5观察指标

6统计学分析

实验结果

1 人脐带血MSCs形态学观察及表面标志的鉴定

2诱导后人脐带血MSCs形态学观察及鉴定

3组织工程神经的制备及检测

4大体观察

5坐骨神经功能指数（SFI）

6坐骨神经电生理检查

7腓肠肌湿重及恢复率

8再生神经纤维组织学检查结果

讨论

1种子细胞

2神经支架材料

3实验分析

4尚存在的问题

结论

参考文献

附录

附录A 英中文术语和缩略语对照表

附录B 个人简介及发表论文

附录C 综述: 间充质干细胞在周围神经组织工程中的研究进展