大肠杆菌来源的HPV6 L1重组蛋白的基础及应用研究

摘要

人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus HPV）能够引起肛生殖器部位的多种良性及恶性病变。在HPV感染所致疾病中，尖锐湿疣是一种相当常见的性传播疾病。虽然该疾病为良性病变，但是具有反复发作，不易痊愈的特点，往往会给患者带来沉重的心理压力及经济负担。尖锐湿疣主要由HPV6及HPV11感染所引起，其中由HPV6感染所引起的占到了70％。因此，一种有效的HPV6疫苗能够显著减少尖锐湿疣的发生和传播。
　　 研究表明HPV L1蛋白在体外组装而成的类病毒颗粒(Virus-Like Particle VLP)是一种良好的HPV疫苗形式，可以诱导高滴度的抗HPV中和抗体。目前，已有两种HPV VLP疫苗上市，其安全性及有效性也得到了充份的证实。但是上述两种疫苗均采用真核表达系统，生产成本高，产品价格昂贵，难以在发展中国家推广。而大肠杆菌表达系统具有培养条件简单，生产成本低廉的突出优点。若将其应用于HPV6 VLP疫苗的研究中将能够降低疫苗成本，促进该疫苗在发展中国家的推广。本研究尝试利用大肠杆菌表达系统制备具有良好免疫原性及稳定的HPV疫苗，并对该疫苗的结构及表位进行分析。
　　 在本研究中并未以包涵体的形式在大肠杆菌中表达重组蛋白HPV6N5C-L1，而是将目的蛋白以非融合的形式可溶地表达于大肠杆菌中。所表达的HPV6N5C-L1蛋白在经过盐析沉淀，复溶，阳离子交换色谱，疏水相互作用色谱这一系列纯化步骤之后，其纯度能够达到96％以上。经纯化的HPV6N5C-L1很好的保持了其天然构象，可以在缓冲液(10mmol/L PB pH6.0，150mmol/L NaCl)中组装为半径约为25nm左右的空心颗粒，具有典型的HPV6 VLP的形态结构。
　　 在上述HPV6VLP小量制备方法基础上，本研究进一步进行了HPV6VLP疫苗的中试研究，以便建立高效，稳定的HPV6 VLP中试工艺。研究结果显示，该工艺不但具有25％左右的较高得率，而且对于目的蛋白具有良好的纯化效果。经过纯化，目的蛋白的纯度能够达到96％以上，而内毒素，外源DNA含量均能够符合药典要求。此外，通过对三批次中试的观察，证实了该工艺同时具有良好的稳定性。
　　 中试研究所制备的HPV6VLP疫苗需要进一步进行免疫原性及稳定性考察。实验结果显示，本研究制备的HPV6 VLP疫苗的ED50为0.009μg，低于对照组中Merck HPV疫苗Gardasil的0.016μg。在稳定性研究中，HPV6 VLP疫苗原液在25℃放置7Day后，其平均水化半径，HPLC保留时间，沉降系数，体外相对抗原含量均未发生明显变化。在37℃放置7天后，HPV6 VLP的平均水化半径有略微增大，而其余检测指标也未见明显变化。上述研究结果证实了本研究所制备的HPV6 VLP具有良好的免疫原性及稳定性。
　　 由于HPV VLP具有复杂的空间构象，而且HPV疫苗的效果也严格依赖于其正确的空间构象的形成。因此本研究在成功制备HPV6 VLP疫苗的基础上进一步对该疫苗的结构及抗原表位进行研究，以阐明HPV6 VLP的结构及表位特征，为建立全面的疫苗质控体系及进行疫苗设计奠定基础。
　　 结构分析显示，组成大肠杆菌来源HPV6 VLP的五聚体在大小，分子量上均与理论值吻合，并且在一定条件下能够形成晶体，具有正确的构象。而HPV6 VLP为空心圆形颗粒，平均约半径为25nm，表面可见壳粒，具有典型的HPV VLP的特征，与真核来源的HPV VLP无异。通过对多个中试批次样品进行分析，可以发现所制备的HPV6VLP在颗粒半径，保留时间，沉降系数等指标上具有高度的一致性。
　　 在表位研究中，本研究筛选得到了HPV6优势中和单抗7A8，13H5，这两株单抗同时还具有HPV6/11交叉中和活性。利用这两株单抗模型与HPV6五聚体模型的分子对接，可以将HPV6的优势中和表位定位于HPV6VLP表面的DE，FG, HI三个环状区域上。而后进一步通过同源扫描的方法验证了上述对接结果，并且进一步将上述表位定位于HPV6VLP表面的三个区域:V138N139V140G141，E259V260G261E262P263V264P265D266 T267L268I269I270, S345T346 Y347T348 N349 S350 D351Y352。
　　 综合上述结果，本研究成功利用大肠杆菌表达系统制备了HPV6 VLP疫苗，验证了其稳定性，有效性及结构正确性，并且对其优势中和表位进行了定位。这些工作将为HPV6疫苗研究及新型HPV疫苗设计提供参考。

目录

声明

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摘要

缩略词

前言

1．HPV研究回顾

2．HPV的结构

2．1．HPV基因组结构

2．2．HPV的早期蛋白

2．3．HPV晚期蛋白与病毒结构

2．4．二硫键与HPV颗粒结构

2．5．L1蛋白的自组装

2．6．表面环状结构与表位

2．7．L2蛋白

3．HPV的分型

4．HPV的感染以及致病机制

5．HPV的免疫

5．1．抗HPV的天然免疫

5．2．抗HPV的特异性免疫

5．3．HPV免疫低反应性以及免疫逃逸的机制

6．HPV感染的诊断

6．1．HPV DNA检测

6．2．HPV抗体检测

7．HPV流行情况以及所致疾病

7．1．高危型与低危型HPV

7．2．HPV感染的传播

7．3．HPV感染的流行情况

7．4．高危型HPV感染所致疾病

7．5．低危型HPV感染所致疾病

8．HPV疫苗研究现状

8．1．HPV疫苗的基本要求

8．2．现有的HPV疫苗

9．蛋白质结构研究及预测

9．1．蛋白质结构研究的实验方法

9．2．蛋白质结构研究的预测方法

9．3．蛋白结构预测在抗体模拟上的应用

9．4．抗体模拟技术的应用前景：

10．B细胞抗原表位定位的研究方法

10．1．B细胞表位的预测法

10．2．B细胞表位定位的实验方法

11．本文研究的思路，目的和意义

材料与方法

1．材料

1．1．主要设备

1．2．菌株、质粒、实验动物

1．3．工作站、软件及其使用模块

1．4．酶和单抗

2．方法

2．1 常用溶液及培养基配制

2．2 常规分子生物学实验方法

2．3 HPV6 L1相关的克隆构建，表达纯化以及检测方法

2．4 疫苗原液及成品检定方法

2．5 分析型超速离心机相关操作

2．6 蛋白质晶体培养

2．7 圆二色光谱测定

2．8 抗HPV6标准血清的制备

2．9 HPV6单抗的制备，鉴定与CDR区测序

2．10 分子模拟与分子对接

结果与分析

第一部分 HPV6 VLP疫苗的研究

1．HPV6 VLP小量制备方法的建立

2．HPV6 VLP疫苗的中试研究

3．HPV6 VLP疫苗免疫原性的考察

4．HPV6 VLP疫苗原液稳定性的考察

5．第一部分小结

第二部分 HPV6 VLP疫苗的结构分析及表位定位

1．HPV6 VLP疫苗的结构分析

2．HPV6 VLP疫苗表位的定位

3．第二部分小结

讨论

1．大肠杆菌表达系统在HPV VLP疫苗研究中的应用

2．HPV抗体的检测

3．HPV疫苗的发展趋势

小结与展望

参考文献

致谢

在校期间发表论文及申请专利