重组大肠杆菌发酵生产多聚体质粒DNA的研究

摘要

质粒DNA作为生物药剂(尤其作为基因治疗和基因疫苗的载体)的意义和需求越来越大。质粒DNA作为一种新的非病毒转基因载体，优点是安全可靠、稳定、对外源基因的容纳量大、不会引起免疫系统反应及易于生产等。多聚体的一个质粒中含有多个目的基因的拷贝，能够提高转染效率和目的基因的表达量，因而受到了特别的关注。但国内外对于多聚体质粒的研究较少，随着基因治疗和DNA疫苗对质粒的需求越来越大，开发一个重复性高、易于放大的多聚体质粒的生产工艺有着重要的意义。 本文对利用重组大肠杆菌(E. coli DH5α)发酵生产二聚体质粒pUC21-dimer和四聚体质粒pUC21-tetramer的培养基及发酵工艺进行系统的研究。首先采用摇瓶实验找出适合菌体生长和质粒复制的培养基组分，接着考察部分培养条件对对菌体生长的影响，然后考察了质粒的稳定性，最后在优化后培养基的基础上对发酵罐补料分批培养的葡萄糖流加策略进行了研究。 摇瓶培养实验优化后的发酵培养基组分为：葡萄糖5.0 g L-1，酵母汁10.0 gL-1，NaCl10.0 g L-1，K2HPO48.0 g L-1，KH2PO44.0 g L-1，柠檬酸1.7 g L-1，MgSO4·7H2O1.2 g L-1，微量元素溶液1.0 mL L-1。发酵条件的考察表明，菌种需要经过高浓度氨苄平板的筛选，才能获得高拷贝数的重组菌，并且经测质粒稳定性，转接20次的重组菌仍然保持高的稳定性。该质粒是温度不敏感型，不适宜用升温策略。 发酵罐培养实验结果表明，对数期流加比稳定期流加能更好地满足菌体的生长，达到的最高生物量和质粒产量也较高。对几种流加方式的考察发现，DO反馈流加方式，操作简单，反馈灵敏，准确度高，获得的生物量和质粒产量均较其他发酵方式高，达到的最高生物量为30.84 g L-1，质粒pUC21-dimer的最大产量为96.38 mg L-1；采用该流加策略发酵生产四聚体质粒，达到的最高生物量为16.44 gL-1，质粒pUC21-tetramer的最大产量为112.06 mg L-1。

目录

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声明

第一章文献综述

1.1基因治疗和基因载体

1.1.1人类基因组计划(Human Genome Project，HGP)

1.1.2基因治疗(gene therapy)

1.1.3基因载体

1.2非病毒转基因载体—质粒DNA

1.2.1质粒DNA概述

1.2.2质粒载体

1.2.3多聚体质粒

1.2.4质粒载体的质量标准

1.3质粒DNA的稳定性

1.3.1分离不稳定

1.3.2结构不稳定

1.4大肠杆菌高密度发酵生产质粒DNA

1.4.1影响高密度发酵的表观因素

1.4.2高密度发酵生产质粒DNA的途径

1.5课题提出的依据及研究目的

1.5.1依据

1.5.2研究目的

第二章材料与方法

2.1实验材料

2.1.1菌种和质粒

2.1.2主要原料及试剂

2.1.3培养基

2.2主要实验仪器

2.3培养方法

2.3.1种子培养方法

2.3.2摇瓶发酵方法

2.3.3发酵罐培养方法

2.4质粒提取法

2.5分析方法

2.5.1菌体生长量测定

2.5.2核酸测定

2.4.3凝胶电泳

2.5.4质粒稳定性的测定

2.5.5葡萄糖浓度的测定

第三章多聚体质粒的鉴定

3.1二聚体质粒的鉴定

3.2四聚体质粒的鉴定

3.3本章小结

第四章摇瓶培养条件的优化

4.1培养基组分优化

4.2碳源优化

4.3氮源优化

4.4氨基酸对菌体生长和质粒产量的影响

4.4.1氨基酸种类对菌体生长和质粒产量的影响

4.4.2氨基酸浓度对菌体生长和质粒产量的影响

4.5培养基优化前后菌体生长和质粒产量的比较

4.6种子的影响

4.7温度效应

4.8质粒的稳定性分析

4.9本章小结

第五章二聚体质粒发酵罐培养工艺的研究

5.1间歇培养

5.2流加培养

5.2.1恒速流加

5.2.2变速流加

5.2.3 pH反馈流加

5.2.4溶氧反馈流加

5.3本章小结

第六章四聚体质粒发酵罐培养工艺的研究

6.1间歇培养

6.2流加培养

6.2.1变速流加

6.2.2 pH反馈流加

6.2.3 DO反馈流加

6.3本章小结

第七章结论与展望

7.1结论

7.2存在问题及展望

参考文献

在读期间发表论文

致 谢