法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2020-05-01
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12N1/21 授权公告日:20160127 终止日期:20190515 申请日:20130515
专利权的终止
2016-01-27
授权
授权
2013-12-18
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N1/21 申请日:20130515
实质审查的生效
2013-11-20
公开
公开
技术领域
本发明属于生物技术领域中质粒DNA疫苗的发酵生产方法及其专用工程菌及高产发酵培养基,特别是涉及基于载体pSVK的乙肝治疗性质粒DNA疫苗(统称pSVK-HBV)的发酵生产方法及其专用工程菌及高产发酵培养基。
背景技术
质粒DNA疫苗具有高安全性、无载体免疫原性和易于生产等特点,因此,同活病毒和病毒基础的疫苗相比,其具有独特的优势。到目前为止,有3种兽用质粒DNA疫苗已经被批准上市,分别是治疗马西尼罗河病毒(West Nile Innovator)、鲑鱼感染性出血坏死病毒((Apex-IHN)、犬黑色素瘤(canine melanoma vaccine)的质粒DNA疫苗。另外,还有1个批准上市的基因治疗方法,用于减少猪仔的死亡率(growth hormone-releasing hormone therapy,LifeTideTMSW5)(Ying Cai,Stephen Rodriguez and Henry Hebel.DNA vaccine manufacture:Scale and quality.Expert Rev.Vaccine)。同时,有多种质粒DNA疫苗,如HIV、肿瘤和HBV等的质粒DNA疫苗,已经发展到临床试验阶段。随着质粒DNA疫苗和基因治疗的发展,对于质粒DNA疫苗的需求将会增大,急需发展简便、省时、高产的质粒DNA疫苗的生产工艺。
实验室规模的质粒DNA生产首先是构建合适的表达载体和筛选最佳宿主菌(一般是大肠杆菌),然后是筛选、优化发酵培养基和发酵条件,并进行产物的分离和纯化(Shuzhen Zheng,Karl Friehs,Ning He,er al.Optimization of Medium Components for Plasmid Production by Recombinant E.coli DH5αpUK21CMVβ1.2.Biotechnology and Bioprocess Engineering2007,12:213-221.)。质粒DNA的发酵是一个关键步骤,因为想要得到较高的产品量,必须使携带质粒DNA的工程菌具有较大菌体量。较高的菌体浓度一般要经过优化培养基的成分和特殊的发酵(补料分批发酵)策略来实现。值得注意的是,如同染色体DNA一样,质粒DNA也是由糖-磷酸骨架和含氮的核苷酸(ATGC)组成。不同于蛋白,DNA大分子的主要成分是碳、磷、氮。同时,根据分子生物学的中心法则可以知道,DNA合成需要的仅仅是复制,而蛋白合成中的转录和翻译则是其它更为复杂的机制(Clarence M Ongkudon,Raelene Pickering,Diane Webster,et al.Cultivation of E.coli carrying a plasmid-based Measles vaccine construct(4.2kbp pcDNA3F)employing medium optimisation and pH-temperature induction techniques.Microbial Cell Factories2011,10:16)。因此,实际上,质粒DNA生产所用的培养基是不同于蛋白生产所用培养基的。
由此可见,设计和筛选一种合适的大肠杆菌工程菌发酵培养基来提高质粒DNA的生产率是非常至关重要的。当前,已经有大规模的大肠杆菌发酵生产蛋白质的技术,然而在质粒DNA发酵培养基的设计和优化中投入的研究还非常少。在这种情况下,建立一种对质粒发酵培养进行优化的科学合理的方法是非常必要的。响应面法(Response surface methodology)已经成为设计实验、建模、寻找响应因子最佳条件最为常用的统计学技术(Zhou WW,He YL,Niu TG,Zhong JJ.Optimization of fermentation conditions for production of anti-TMV extracellular ribonuclease by Bacillus cereus using response surface methodology.Bioprocess Biosyst Eng,2010,33:657–663.),其中,Plackett-Burman(PB)设计常用于从众多变量中筛选主要影响因子,这也是优化的第一步,而接下来是进行最陡爬坡法和中心组合法(CCD)进行影响因子最佳浓度的筛选和确定(Li X,Xu T,Ma X,et al.Optimization of culture conditions for production of cis-epoxysuccinic acid hydrolase using response surface methodology.Bioresour Technol,2008,99:5391–5396.)。
发明内容
本发明的目的是提供一个稳定性高、能多次传代的用于发酵生产乙肝治疗性质粒DNA疫苗pSVK-HBV的工程菌。
本发明所提供的用于发酵生产基于载体pSVK的乙肝治疗性质粒DNA疫苗(统称pSVK-HBV)的工程菌,是转化有乙肝治疗性质粒DNA疫苗pSVK-HBV的大肠杆菌XL10-Gold,命名为E.coli XL10-Gold/HBV;所述载体pSVK为携带卡那霉素抗性基因的复制子DAN疫苗载体,其核苷酸序列如序列表中序列1所示。
所述质粒DNA疫苗pSVK-HBV是以载体pSVK为基础,放入一种或多种乙肝抗原和/或一种或多种相关佐剂基因构建而成的乙肝治疗性复制子DNA疫苗,乙肝抗原包含HBV C区抗原、HBV S区抗原和由C区和S区组合的HBV CS区抗原,佐剂包含通用CD4细胞表位PADRE、FL、人IgGFc、GPI、GM-CSF和B7.1;其中,以载体pSVK为基础放入核苷酸序列由序列表中序列4所示的HBV复合抗原CS基因构建而成的乙肝治疗性复制子DNA疫苗,命名为pSVK-CS;以载体pSVK为基础放入放入乙肝抗原CS与多种佐剂基因组合构成的乙肝治疗性复制子DNA疫苗命名为pSVK-HBVA,其核苷酸序列由序列表中序列5所示。
该工程菌,是将乙肝治疗性质粒DNA疫苗pSVK-HBV的质粒DNA转化大肠杆菌 XL10-Gold得到的转化菌XL10-Gold,转化方法包括但不限于氯化钙法、电击转化法、Hananhan法和Inoue法;将转化菌XL10-Gold涂布于LB固体平板培养基,在37℃、200rpm下培养15小时后挑取单克隆菌落;将单克隆菌落接种于5mL LB液体培养基中,在37℃、200rpm下培养12小时后按照1:100进行连续传代培养,12小时转接传代1次,可连续传代30代;单克隆菌株以及传代30代以内历次传代菌株均为转化大肠杆菌XL10-Gold的工程菌。
用氯化钙法转化大肠杆菌XL10-Gold的工程菌,转化方法包括:将-70℃保存的100μl感受态细胞XL10-Gold于冰浴中解冻10分钟,加入pSVK-HBV质粒DNA25-50ng,轻柔混匀后,置冰浴中30分钟;冰浴结束后,于42℃水浴中热击90秒,后迅速置于冰浴中冷却3-5分钟,向管中加入800μl无抗性的LB液体培养基,混匀后于37℃,200rpm振荡培养1小时,得到pSVK-HBV质粒DNA的转化菌XL10-Gold。
本发明另一目的是提供一种用于发酵生产乙肝治疗性质粒DNA疫苗pSVK-HBV的高产发酵培养基。
用于发酵生产乙肝治疗性质粒DNA疫苗pSVK-HBV的高产发酵,每1L培养基含:眎蛋白胨10g-20g,酵母粉3g-5g,NaCl8g-10g,甘油0.5g-0.65g,Na2HPO46.4g-16.0g,K2HPO42g-5g,MgSO40.12g-0.36g,NH4Cl1.0g-3.5g,微量元素0.5mL-1.5mL。
较佳的,每1L培养基(ILB)含:眎蛋白胨16.5g,酵母粉5g,NaCl10g,甘油0.65g,Na2HPO412.8g,K2HPO43g,MgSO40.24g,NH4Cl3.1g,微量元素1mL。
或者,每1L培养基(iLB)含:眎蛋白胨10g,酵母粉5g,NaCl10g,甘油0.5g,Na2HPO412.8g,K2HPO43g,MgSO40.24g,NH4Cl1g,微量元素1mL。
所述微量元素包括:FeCl3.6H2O27g/L,ZnCl22g/L,CoCl2.6H2O2g/L,Na2MoO4.2H2O2g/L,无水CaCl20.76g/L,CuCl2.2H2O1.27g/L,H3BO30.5g/L,溶于1.2N HCl中。
本发明另一目的在于提供一种生产乙肝治疗性质粒DNA疫苗pSVK-HBV的方法。
该方法是复苏一支所述工程菌E.coli XL10-Gold/HBV工作种子,按体积比1:100接种于5mL LB液体培养基中,在37℃、200rpm下培养12小时,按照1:100再转接于100mL的LB液体培养基中,37℃、200rpm培养12小时左右得到种子液;将种子液按照1:100的量接种于含3L所述发酵培养基的5L发酵罐内,pH值控制在7.0±0.1,通过发酵罐自动补入H2SO4和NH3.H20来调节培养基的pH值。培养温度为37℃,溶解氧控制在30%左右,发酵培养6h后;之后按照1mL/min的流速补加发酵培养基,总共补加500mL,发酵15小时后,结束发酵,收菌,提取质粒,得到乙肝治疗性质粒DNA疫苗pSVK-HBV。
本发明还一目的是提供生产乙肝治疗性质粒DNA疫苗pSVK-HBV的工程菌工程菌E.coli XL10-Gold/HBV种子库的构建方法及种子库产品。
工程菌E.coli XL10-Gold/HBV种子库的构建方法,包括:
1)制备原始种子库:将所述工程菌E.coli XL10-Gold/CAVA菌液0.5mL扩大至100mL LB液体培养基中,在37℃、200rpm下培养12小时,加入30%甘油,分装50管并冻存于-70℃冰箱,得到由原始种子组成的原始种子库;
2)制备主种子库:复苏一支原始种子接种于12管LB液体培养基中,2次传代后小提质粒,选取质粒含量最高的菌液扩大至100mL LB培养基中,在37℃、200rpm下培养12小时后加入30%甘油,并分装50管得到主种子库,冻存于-70℃冰箱,得到由主种子组成的主种子库;
3)制备工作种子库:从主种子库中取1管菌种,接种于12管LB液体培养基中,2次传代后小提质粒,选取质粒含量最高的菌液扩大至100mL LB培养基中,在37℃、200rpm下培养12小时后加入30%甘油,分装50管并冻存于-70℃冰箱,得到由工作种子组成的工作种子库;每支工作种子库中的菌种限传5代用于乙肝治疗性质粒DNA疫苗pSVK-HBV的生产。
由所述方法构建得到的工程菌E.coli XL10-Gold/HBV种子库,包括原始种子、主种子及工作种子也属于本发明内容。
在治疗性质粒DNA疫苗生产中,质粒DNA稳定性和工程菌发酵培养基是影响质粒产量的重要因素,本发明为了能提供一个稳定性高、能多次传代的用于发酵生产乙肝治疗性质粒DNA疫苗pSVK-HBV的工程菌以满足中试及发酵生产工艺的需求,通过实验对宿主菌进行了优化筛选,发现大肠杆菌XL10-Gold是一个更利于质粒DNA疫苗pSVK-HBV扩增的宿主菌,将携带质粒pSVK-HBV的工程菌命名为E.coli XL10-Gold/HBV,质粒pSVK-HBV以大肠杆菌XL10-Gold为宿主菌时,表现出了同常规质粒DNA类似的稳定性,能转接传代30次也未发生重组或片段丢失,这可能与大肠杆菌XL10-GOLD的特性有关系,因为该菌具有一个大分子量质粒高效转化基因;除了保持质粒DNA在宿主菌中的稳定传代以外,质粒DNA生产工艺中极为重要的一个方面是质粒DNA的高产量问题,想要得到较高的产品量,必须使携带质粒的工程菌具有较高的菌体量,一般要经过优化培养基的成分和特殊的发酵(补料分批发酵)策略来实现,而理想的发酵培养基是获得高产量的首要条件,因此,分别用单次单因子法和响应面法对其最适培养基进行了筛选和优化,单次单因子法优化结果显示,LB培养基是其最适基础培养基,质粒DNA的容积产率为5.5mg/L,明显高于TB和M9培养基,虽然利用TB培养基发酵时能获得最高的菌体量,但是质粒DNA的产量与其并不成正比, 其原因可能是由于TB培养基发酵时,工程菌生长速度过快,造成质粒的复制速度不能与菌体分裂生长同步,发生了质粒DNA的丢失;最适碳源和氮源分别是甘油和国产的眎蛋白胨,无机盐和微量元素对质粒的产量有一定的提高作用,而维生素B1作用不显著;PB实验结果表明,影响质粒产量的3个主要影响因子为眎蛋白胨、甘油、NH4Cl,最后经过最陡爬坡和CCD优化后,确定了工程菌E.coli XL10-Gold/HBV发酵培养基的成份和水平,在500mL摇瓶的发酵规模下,质粒DNA的容积产率最高能达到13.61mg/L,是基础培养基LB发酵产量的2倍以上。综上所述,本发明的工程菌及培养基将在乙肝治疗性质粒DNA疫苗pSVK-HBV的发酵生产中发挥重要作用,应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1为琼脂糖凝胶电泳检测不同宿主菌中乙肝治疗性质粒DNA疫苗pSVK-HBV的稳定性;图中,对照:pSVK-HBVA质粒;1-3:宿主菌为大肠杆菌DH5α;4-6:宿主菌为大肠杆菌DH10β;7-9:宿主菌为大肠杆菌Top10;10-12:宿主菌为大肠杆菌XL10-Gold。
图2为工程菌E.coli XL10-Gold/HBV三级种子批的分子生物学和生化鉴定结果;B幅中,1:pSVK-HBVA质粒;M:15kb Maker;D幅中,1:pSVK-HBVA质粒;2:pSVK-HBVA质粒单酶切(BamH I);3:pSVK-HBVA质粒双酶切(BamH I/BssH II);M:15kb Maker。
图3为不同培养基发酵后工程菌E.coli XL10-Gold/HBV中质粒产量(容积产率)的比较结果。
图4为不同碳源对工程菌E.coli XL10-Gold/HBV质粒产量(容积产率)的影响。
图5为不同氮源对工程菌E.coli XL10-Gold/HBV质粒产量(容积产率)的影响。
图6为无机盐、微量元素和维生素对工程菌E.coli XL10-Gold/HBV质粒产量(容积产率)的影响。
图7为三个显著影响因子对质粒产量(容积产率)影响的曲面及等值线图;
A1幅表示质粒容积产率(mg/L)与甘油(g/L),眎蛋白胨(g/L)的曲面图;
A2幅表示质粒容积产率(mg/L)与甘油(g/L),眎蛋白胨(g/L)的等值线图;
B1幅表示质粒容积产率(mg/L)与氯化铵(g/L),眎蛋白胨(g/L)的曲面图;
B2幅表示质粒容积产率(mg/L)与氯化铵(g/L),眎蛋白胨(g/L)的等值线图;
C1幅表示质粒容积产率(mg/L)与氯化铵(g/L),甘油(g/L)的曲面图;
C2幅表示质粒容积产率(mg/L)与氯化铵(g/L),甘油(g/L)的等值线图。
图8为载体pUC19-PS的PCR和酶切鉴定结果;M1:DL2000Marker,M2:DL15000 Marker,1:pUC19质粒,2:pUC19/Xba I+Sph I,3:PS/Xba I+Sph I,4:pUC19-PS质粒,5:PCR鉴定,6:pUC19-PS/Spe I+Xho I。
图9为载体pUC19-PS-KANA的PCR和酶切鉴定结果;M1:DL2000Marker,M2:DL15000Marker,1:pUC19-PS质粒,2:pUC19-PS/Spe I+Xho I,3:KANA/SpeI+XhoI,4:pUC19-PS-KANA质粒,5:PCR鉴定,6:pUC19-PS-KANA/Xba I+HindⅢ。
图10为转化有pSVK重组载体的抗性筛选结果。
图11为载体pSVK的PCR和酶切鉴定结果;M1:DL2000Marker,M2:DL15000Marker,1:pSCA1/SphI+补平+SpeI,2:pSCA1回收片段,3:pUC19-PS-KANA/HindⅢ+补平+SpeI,4:pUC19-PS-KANA回收片段,5:pSCA1-KAKA质粒,6:PCR鉴定(扩KANA),7:PCR鉴定(扩PS+KANA)。
图12为疫苗Psvk-CS的菌落PCR鉴定结果。
具体实施方式
本发明的发明人前期经研究获得了基于甲病毒复制子载体的新型乙肝治疗性质粒DNA疫苗pSVK-HBV,该疫苗能够清除病毒并高效抑制病毒复发反弹,在初步药效学试验中取得了非常理想的效果。基于甲病毒复制子载体的质粒DNA疫苗一般分子量都较大,能达到14kb以上,分子量如此大的质粒无论是在上游的设计和构建,还是到下游的提取和工艺研究,都具有较大的挑战性。前期的实验发现:在以大肠杆菌DH5 α为宿主菌时,随着传代次数的增加,质粒DNA疫苗pSVK-HBV会发生分子量变小的情况,代数越多变小的情况越严重,到最后提取的质粒DNA已经不是所需要的目的质粒DNA,这对于后续的中试工艺研究以及产品的发展极为不利。推测,是由于质粒DNA在宿主菌里发生了重组或丢失,造成宿主菌里质粒DNA发生重组或片段丢失与质粒DNA本身的特性以及宿主菌等都有一定的关联,首先乙肝治疗性质粒DNA疫苗pSVK-HBV是一种基于病毒的载体,比常规的质粒DNA更易发生重组或片段丢失;另外,由于该质粒pSVK-HBV自身相对分子质量将近14kb,在宿主菌里复制时会给菌体造成严重的负荷,从而引发质粒DNA的不稳定性增加,产生上述质粒DNA变小的情况。想要解决这个问题,一种办法是降低宿主菌本身的负荷,比如降低培养温度、降低摇床转速,让菌生长速度下降,另一种方法就是筛选最适宜的宿主菌,并进行培养基成分及发酵培养条件的优化。
本发明针对乙肝治疗性质粒DNA疫苗pSVK-HBV的发酵生产,首先提供用于发酵生产乙肝治疗性质粒DNA疫苗pSVK-HBV的工程菌,它是转化有乙肝治疗性质粒DNA疫苗pSVK-HBV的大肠杆菌XL10-Gold,命名为E.coli XL10-Gold/HBV。
可用本领域技术人员熟知的常规技术,将乙肝治疗性质粒DNA疫苗pSVK-HBV转化大肠杆菌XL10-Gold,转化方法包括但不限于Hananhan法(分子克隆实验指南(第三版)87-92页)、Inoue法(分子克隆实验指南(第三版)93-96页)、氯化钙法(分子克隆实验指南(第三版)96-99页)、电击转化法(分子克隆实验指南(第三版)99-102页)。
本发明还提供了一种用于制备乙肝治疗性质粒DNA疫苗pSVK-HBV的高产发酵培养基,每1L培养基含:眎蛋白胨12.5g-20.0g,酵母粉3g-5g,NaCl8g-10g,甘油0.5g-0.65g,Na2HPO46.4g-16.0g,K2HPO42g-5g,MgSO40.12g-0.36,NH4Cl1.5g-3.5,微量元素0.5mL-1.5mL。
优化的,每1L培养基(ILB)含:眎蛋白胨16.5g,酵母粉5g,NaCl10g,甘油0.65g,Na2HPO412.8g,K2HPO43g,MgSO40.24g,NH4Cl3.1g,微量元素1mL,用水定容至1L。微量元素包括FeCl3.6H2O27g/L,ZnCl22g/L,CoCl2,6H2O2g/L,Na2MoO4,2H2O2g/L,无水CaCl20.76g/L,CuCl2.2H2O1.27g/L,H3BO30.5g/L,溶于1.2N HCl中。
本发明还提供了一种用上述工程菌和高产发酵培养基制备乙肝治疗性质粒DNA疫苗pSVK-HBV的方法,包括以下步骤:
1)种子液的制备:从-70℃复苏一支E.coli XL10-Gold/HBV工作种子,按1:100接种于5mL的LB液体培养基中,37℃、200rpm培养12小时。按照1:100再转接于 100mL的LB液体培养基中,37℃、200rpm培养12小时左右,此时得到种子液;
2)中试发酵:将种子液按照1:100的量种于5L发酵罐内进行发酵培养(发酵罐内含有高产发酵培养基ILB的量为3L),pH值控制在7.0±0.1,通过发酵罐自动补入H2SO4和NH3.H20来调节培养基的pH值。培养温度为37℃,溶解氧控制在30%左右,当溶解氧降低到该值时,通过补充纯氧和提高搅拌速度来调节。发酵培养6h后,按照1mL/min的流速补加高产发酵培养基ILB,总共补加500mL。发酵15小时后,结束发酵,收菌,提取质粒,得到乙肝治疗性质粒DNA疫苗pSVK-HBV
所述E.coli XL10-Gold/HBV工作种子,可以由以下方法制备得到;
1)制备原始种子库:将E.coli XL10-Gold/HBV工程菌菌液0.5mL扩大至100mL LB液体培养基中,在37℃、200rpm下培养12小时,加入30%甘油,分装50管并冻存于-70℃冰箱,得到原始种子库;
2)制备主种子库:复苏一支原始种子接种于12管LB液体培养基中,2次传代后小提质粒,选取质粒含量最高的菌液扩大至100mL LB培养基中,在37℃、200rpm下培养12小时后加入30%甘油,并分装50管得到主种子库,冻存于-70℃冰箱;
3)制备工作种子库:从主种子库中取1管菌种,接种于12管LB液体培养基中,2次传代后小提质粒,选取质粒含量最高的菌液扩大至100mL LB培养基中,在37℃、200rpm下培养12小时后加入30%甘油,分装50管并冻存于-70℃冰箱,得到工作种子库,用于常规生产,每支工作种子库中的菌种限传5代。
本发明中,所述载体pSVK是申请人创新的携带卡那霉素抗性基因的复制子DAN疫苗载体,其核苷酸序列如序列表中序列1所示,实施例中给出了其详细的构建过程。
所述乙肝治疗性质粒DNA疫苗pSVK-HBV是以复制子DNA疫苗载体pSVK为基础,放入一种或多种乙肝抗原和/或一种或多种相关佐剂基因(目标基因)构建而成的乙肝治疗性复制子DNA疫苗。乙肝抗原包含HBV C区抗原、HBV S区抗原和由C区和S区组合的HBV CS区抗原,佐剂包含通用CD4细胞表位PADRE、FL、人IgGFc、GPI、GM-CSF和B7.1。按载体及目标基因构成来命名,乙肝治疗性质粒DNA疫苗pSVK-HBV至少包含pSVK-CS,pSVK-C,pSVK-S,以及抗原CS与上述多种佐剂组合构成的pSVK-HBVA,由所述不同乙肝抗原与不同佐剂组合可能构成的所有治疗性疫苗质粒也包含在内。其中,以载体pSVK为基础放入核苷酸序列由序列表中序列4所示的HBV复合抗原CS基因构建而成的乙肝治疗性复制子DNA疫苗命名为pSVK-CS,以载体pSVK为基础放入放入乙肝抗原CS与多种佐剂基因组合构成的乙肝治疗性复制子DNA疫苗命名为pSVK-HBVA,其核苷酸序列由序列表中序列5所示。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法,具体步骤可参见: 《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook,J.,Russell,David W.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd edition,2001,NY,Cold Spring Harbor)。
所述百分比浓度如无特别说明均为质量/体积(W/V)百分比浓度或体积/体积(V/V)百分比浓度。
实施例中描述到的的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的,不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上,所用到的生物材料的来源是广泛的,任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方式和具体的操作过程,实施例将有助于理解本发明,但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1、乙肝治疗性质粒DNA疫苗pSVK-HBV质粒DNA的构建及其高稳定性宿主菌的筛选
一、构建乙肝治疗性质粒DNA疫苗pSVK-HBV
以得到pSVK-CS和pSVK-HBVA为例介绍乙肝治疗性质粒DNA疫苗pSVK-HBV宿主菌的筛选和实验。
1、复制子DNA疫苗载体pSVK的构建:
1)扩增PS基因:以含有氨苄青霉素抗性基因的复制子DNA疫苗载体pSCA1(构建方法参见文献Yu Y Z,Sun Z W,Yu W Y.Chinese Journal of Biotechnology,2005,21(5):33-38)为模板,在引物PSCA-F(5’-CCGTCTAGAGATCATAATCAGCCAT-3’)和PSCA-R(5’-CCGGCATGCCTCGAGACTAGTCTGTCAGACCAAG-3’)的引导下PCR扩增氨苄青霉素抗性基因的旁侧序列,所述5’端旁侧序列含有限制性内切酶Xba I识别位点,所述3’端旁侧序列含有限制性内切酶Sph I识别位点;PCR反应体系为:10×PCR缓冲液10μl,MgCl2(2.5mM)10μl,dNTPs混合物(2.5mM)8μl,合成引物(20μM)PSCA-F和PSCA-R各2μl,Taq DNA聚合酶(5U/μl)2μl,加去离子水至100μl;PCR反应条件为:先94℃预变性5min;然后94℃变性1min,55℃退火1min,72℃延伸1min,共30个循环,最后72℃继续延伸10min;反应结束后,对PCR扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,检测结果表明经PCR扩增获得了全长1273bp的基因片段,回收并纯化该基因片段,测序,测序结果表明该基因片段的核苷酸序列如序列表中序列2所示,与预期结果相符,将该基因片段命名为PS基因。
然后,将PS基因用限制性内切酶Xba I和Sph I进行双酶切后,与同样经Xba I和Sph I双酶切的载体pUC19连接;将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经 浓度50μg/mL的氨苄青霉素抗性筛选,挑选阳性克隆,进行PCR和酶切鉴定,鉴定结果如图8所示(M1:DL2000Marker,M2:DL15000Marker,1:pUC19质粒,2:pUC19/Xba I+Sph I,3:PS/Xba I+Sph I,4:pUC19-PS质粒,5:PS基因的PCR鉴定结果,6:pUC19-PS/Spe I+Xho I),表明得到了序列及插入位置均正确的携带PS基因的重组载体,命名为pUC19-PS。
2)获得PS与KANA融合基因(PS-KANA):以含有卡那霉素抗性基因的载体pVAX1(购自Invitrogen公司)为模板,在引物KANA-F(5’-CCGACTAGTATGATTGAACAAG-3’)和KANA-R(5’-CCGCTCGAGTCAGAAGAACTCGTC-3’)的引导下PCR扩增5’端携带限制性内切酶Spe I识别位点、3’端携带限制性内切酶Xho I识别位点的卡那霉素抗性基因;PCR反应体系为:10×PCR缓冲液5μl,MgCl2(2.5mM)5μl,dNTPs混合物(2.5mM)4μl,合成引物(20μM)KANA-F和KANA-R各1μl,Taq DNA聚合酶(5U/μl)1μl,加去离子水至50μl;PCR反应条件为:先94℃预变性5min;然后94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,共30个循环,最后72℃继续延伸10min;反应结束后,对PCR扩增产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测,检测结果表明经PCR扩增获得了全长795bp的基因片段,回收并纯化该基因片段,测序,测序结果表明该基因片段的核苷酸序列如序列表中序列3所示,与预期结果相符,将该基因片段命名为KANA;然后将KANA基因用限制性内切酶SpeI和Xho I进行双酶切后,与同样经SpeI和Xho I双酶切的重组载体pUC19-PS(步骤1)得到)连接;将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经浓度50μg/mL的氨苄青霉素抗性筛选,挑选阳性克隆,进行PCR和酶切鉴定;鉴定结果如图9所示(M1:DL2000Marker,M2:DL15000Marker,1:pUC19-PS质粒,2:pUC19-PS/Spe I+Xho I,3:KANA/SpeI+XhoI,4:pUC19-PS-KANA质粒,5:PS-KANA基因的PCR鉴定结果,6:pUC19-PS-KANA/Xba I+HindⅢ),表明用上述方法构建得到了序列及插入位置均正确的携带PS与KANA融合基因(PS-KANA)的重组载体,命名为pUC19-PS-KANA。
3)抗性基因置换:将复制子DNA载体pSCA1中的氨苄青霉素基因置换为卡那霉素基因具体方法为:将载体pSCA1先用SphI单酶切,回收并纯化后在DNA聚合酶I(Klenow)的作用下,将酶切后产生的粘性末端补平后回收、纯化,再用SpeI进行单酶切并回收、纯化后作为目的载体(该目的载体的一端为平末端,另一端则是粘性末端SpeI),经过该步操作载体pSCA1中的氨苄抗性基因及其旁侧序列已被酶切去除;将步骤2)得到的重组载体pUC19-PS-KANA先用Hind Ⅲ单酶切,回收并纯化后在DNA聚合酶I(Klenow)的作用下,将酶切后产生的粘性末端补平后回收、纯化,然后再用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)进行去磷酸化处理,最后再用Xba I单酶切,回收并纯 化2100bp的DNA片段(该DNA片段的一端为平末端,另一端为粘性末端XbaI),该步酶切回收的DNA片段主要包含有pSCA1载体中氨苄抗性基因的旁侧序列与KANA抗性基因的融合基因即PS-KANA;利用SpeI和XbaI属于同尾酶的特性,将回收并纯化的目的载体和DNA片段连接,经该步操作,PS-KANA融合基因被连入载体pSCA1中原氨苄基因及其旁侧序列所在位置,实现了pSCA1载体中抗性基因的置换;将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,进行抗性筛选,筛选结果如图10所示(左图:含浓度50μg/mL氨苄青霉素的LB培养平板,右图:含浓度50μg/mL卡那霉素的LB培养平板),连接产物转化入大肠杆菌DH5α中后在氨苄青霉素抗性的LB平板中不再生长,而在含有卡那霉素抗性的LB平板中生长良好,表明复制子DNA疫苗载体pSCA1中的氨苄青霉素基因被成功置换为卡那霉素基因;再进行PCR和酶切鉴定,鉴定结果如图11所示(M1:DL2000Marker,M2:DL15000Marker,1:pSCA1/SphI+补平+SpeI,2:pSCA1回收片段,3:pUC19-PS-KANA/Hind Ⅲ+补平+Xba I,4:pUC19-PS-KANA回收片段,5:pSCA1-KAKA质粒,6:pSVK的PCR鉴定结果(扩KANA基因)6:pUC19-PS-KANA的PCR鉴定结果(扩PS+KANA基因)),表明用上述方法构建得到了序列及插入位置均正确的携带卡那霉素抗性基因的复制子DAN疫苗载体,命名为pSVK,测序结果表明pSVK的核苷酸序列如序列表中序列1所示。
2、乙肝治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CS的构建
1)HBV复合抗原CS基因的设计与获得
在NCBI网站中搜索HBV C、S、PreS等基因的相关序列(HBV C区抗原基因的Genebank号为GI:387538420;大S区抗原包括S、PreS1和PreS2,其基因的Genebank号为GI:387538384),选取免疫优势抗原区段,将通用CD4细胞表位PADRE(Tobias-Machado M,Correa TD,De Barros EL,et al.Int Braz J Urol.2003Jul-Aug;29(4):313-319)以及PreS1(61-141bp)和PreS2(397-435bp)抗原表位插入并替换HBcAg(乙肝核心抗原C抗原)的刺突区(226-252bp),然后再和乙肝表面抗原s抗原HBsAg(1-666bp)的基因区段进行融合,构成HBV复合抗原CS。自上游至下游顺次连接的HBV C区抗原基因(Genebank号GI:387538420)自5’端至3’端第1-225bp、通用CD4细胞表位PADRE(Pan-allelic DR epitope,PADRE)、HBV PreS1抗原(Genebank号GI:387538384)自5’端至3’端第61-141bp、HBV PreS2抗原(Genebank号GI:387538384)自5’端至3’端第397-435bp、HBV C区抗原基因(Genebank号GI:387538420)自5’端至3’端第253-453bp、HBV S抗原基因(Genebank号GI:387538384)自5’端至3’端第1-666bp。其中,通用CD4细胞表位PADRE(Pan-allelic DR epitope,PADRE)其氨基酸序列为AKFVAA WTLKAAA,碱基序列为 gcgaaatttgtggccgcgtggaccctgaaggcagctgcg,能和人类及多种动物不同DR分子结合,提呈于细胞表面,进而激活CD4+T辅助细胞,发挥免疫调节作用。
由擎科生物技术有限公司合成HBV复合抗原CS基因后连入pMD18-T载体(TaKaRa公司)中,得到包含HBV复合抗原CS的测序质粒pMD18-T-CS,HBV复合抗原CS基因的核苷酸序列如序列表中序列4所示(1260bp)。
2)、构建乙肝治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CS质粒DNA
用限制性内切酶SmaⅠ和BamHⅠ双酶切pMD18-T-CS,回收大小约为1260bp的HBV复合抗原CS基因,与同样经Sma Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切的载体pSVK进行连接;连接后的产物转化大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞,在含浓度50μg/mL卡那霉素的LB培养平板进行抗性筛选,挑取单菌落,进行菌液PCR鉴定,利用上游引物CS-F:5’-ATGGACATTGACCCTTAT-3’和下游引物为CS-R:5’-GAGACAAAAGAAAATTG-3’进行PCR扩增;PCR反应体系为:10×PCR缓冲液10μl,MgCl2(2.5mM)10μl,dNTPs混合物(2.5mM)8μl,引物(20μM)CS-F和CS-R各2μl,Taq DNA聚合酶(5U/μl)2μl,加去离子水至100μl;反应条件为:95℃预变性5min;94℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸1min,30个循环;72℃延伸7min,4℃保存。鉴定结果如图12所示(M1:DNA Marker(DL10000);1-2:pSVK-CS菌落PCR扩增产物),PCR鉴定呈阳性的质粒,送北京三博远志生物技术有限责任公司测序,结果与预期设计完全一致,表明用上述方法获得了乙肝治疗性质粒DNA疫苗质粒DNA(命名为pSVK-CS),该质粒用于以下实验中。
3、乙肝治疗性复制子DNA疫苗pSVK-HBVA的构建
乙肝治疗性复制子DNA疫苗pSVK-HBVA,是以载体pSVK为基础携带复合乙肝抗原基因的重组复制子DNA疫苗。
1)复合乙肝抗原基因的构成
多种组合的复合乙肝抗原基因均可用于乙肝治疗性复制子DNA疫苗pSVK-HBV的构建。其中一种组合的复合乙肝抗原基因可命名为HBV-CS,其自上游至下游顺次连接HBV C区抗原基因(Genebank号GI:387538420)自5’端至3’端第1-225bp、通用CD4细胞表位PADRE(Pan-allelic DR epitope,PADRE)、HBV PreS1抗原(Genebank号GI:387538384)自5’端至3’端第61-141bp、HBV PreS2抗原(Genebank号GI:387538384)自5’端至3’端第397-435bp、HBV C区抗原基因(Genebank号GI:387538420)自5’端至3’端第253-453bp、HBV S抗原基因(Genebank号GI:387538384)自5’端至3’端第1-666bp;其中,通用CD4细胞表位PADRE为佐剂,能和人类及多种动物不同DR分子结合,提呈于细胞表面,进而激活CD4+T辅助细胞, 发挥免疫调节作用[Tobias-Machado M,Correa TD,De Barros EL,et al.Int Braz J Urol.2003Jul-Aug;29(4):313-319]。
进一步,复合乙肝抗原基因HBV-CS的5’端再连接佐剂基因FL(Genebank号GI:325197203)的胞外段基因;将由FL的胞外段基因和复合乙肝抗原基因HBV-CS构成的融合基因命名为FL-CS。
为了加强复合抗原的免疫递呈,融合基因FL-CS的3’端再连接佐剂人IgGFc段基因(GenBank号:Z17370);为了使复合抗原能够富集在细胞膜上,进一步加强抗原的递呈和免疫激活,在人IgGFc段基因的3’端还连接糖基化磷脂酰肌醇GPI基因(GenBank号:XM676434),使复合抗原基因通过基因3’端的GPI锚定信号表达在细胞膜上,该融合基因包括FL-CS、人IgG Fc段和糖基化磷脂酰肌醇GPI基因,因为GPI序列较短,而且只参与细胞膜锚定,并不参与免疫应答环节,所以将该融合抗原基因命名为FL-CS-Fc。
为了增强免疫激活和免疫共刺激,通过内部核糖体进入位点IRES实现复合抗原基因FL-CS-Fc与免疫调节因子基因在同一质粒中共表达,所述HBV复合抗原基因FL-CS-Fc位于IRES序列的上游,免疫调节因子GM-CSF基因(Genebank号GI:NM-000758)和B7.1基因(Genebank号GI:NM-005191)等免疫分子基因位于IRES序列的下游,将该融合基因命名为FL-CS-Fc-IRES-GM/CSF-B7.1。其中,FL、CS与Fc段之间为直接连接构成融合抗原,依靠抗原基因5’端的FL和3’端的Fc段实现融合抗原基因双向靶向DC的免疫功能;GM-CSF和B7.1之间通过一个能被细胞内普遍存在的弗林蛋白酶(furin)识别8肽连接(详见刘宁,阎瑾琦,冉多良等.肿瘤基因疫苗免疫增效载体pVAX1-IRES-GM/B7的构建与表达.军事医学科学院院刊,2008,32(3):249-52)。用常规操作制备融合基因,在此不赘述。
2)、构建乙肝治疗性质粒DNA疫苗pSVK-HBVA质粒DNA
用与2之2)类似的操作,使融合基因FL-CS-Fc-IRES-GM/CSF-B7.1与同样载体pSVK进行连接,制备获得了乙肝治疗性质粒DNA疫苗(命名为pSVK-HBVA)质粒DNA,其核苷酸序列由序列表中序列5所示。该质粒也用于以下实验中。
二、乙肝治疗性质粒DNA疫苗pSVK-HBV的高稳定性宿主菌的筛选
将乙肝治疗性质粒DNA疫苗pSVK-HBV质粒DNA(以使用pSVK-CS为例)分别转化不同基因型的大肠杆菌感受态细胞DH5α、DH10β、Top10和XL10-Gold,转化方法为Hananhan法(分子克隆实验指南(第三版)87-92页)、Inoue法(分子克隆实验指南(第三版)93-96页)、氯化钙法(分子克隆实验指南(第三版)96-99页)、电击转化法(分子克隆实验指南(第三版)99-102页)。
以氯化钙法转化XL10-Gold为例进行示例性说明:
从-70℃冰箱中取100μl感受态细胞,立即于冰浴中解冻10分钟,然后加入pSVK-HBV质粒DNA(以pSVK-HBVA和pSVK-CS为例)25-50ng,轻柔混匀后,置冰浴中30分钟。冰浴结束后,于42℃水浴中热击90秒,后迅速置于冰浴中冷却3-5分钟,向管中加入800μl无抗性的LB液体培养基,混匀后于37℃,200rpm振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因,此时得到质粒pSVK-HBV的转化菌;
将转化菌涂布于LB固体平板培养基(LB液体培养基配方:胰蛋白胨10g,酵母提取物5g,NaCl10g,加入蒸馏水溶解,5N NaOH调节pH至7.0,定容至1000mL,高压灭菌后4℃保存备用。固体平板培养基则是在LB液体培养基中加入琼脂(15g/L),高压灭菌,当温度降至50℃时加入Kana(化学名称为硫酸卡那霉素)至终浓度为30μg/mL,以下培养基均为此抗性水平),在37℃细菌培养箱中培养12小时后挑取单克隆菌落,接种于5mL LB液体培养基中,在37℃、200rpm摇床中培养12小时后按照1:100进行连续传代培养(12小时转接传代1次),传代之前取1mL菌液抽提质粒,通过1%琼脂糖凝胶电泳检测质粒的形态以及超螺旋比例,紫外分光光度计测量质粒浓度,联合连续传代法(每12小时转接1代)对工程菌的稳定性进行检测。
检测结果如图1(A.转接传代到第2代B.转接传代到第3代C.转接传代到第4代D.转接传代到第5代)所示,从第3代开始就已经出现了质粒DNA变小的情况(参见图1的B幅),在传代到第4代时,宿主菌为大肠杆菌DH5α、DH10β和Top10的单克隆培养物中的质粒形态全部发生了改变,出现了变小的情况,而且随着传代次数增加越来越严重(参见图1的C),这提示在这些宿主菌中的质粒pSVK-HBV发生了重组或片段丢失。然而,宿主菌为大肠杆菌XL10-Gold的单克隆从第4代才出现一些质粒变小的情况,并且到第5代仍然存在比较稳定、未发生质粒DNA片段丢失的单克隆培养物(参见图1的D),这提示大肠杆菌XL10-Gold可以作为发酵制备乙肝治疗性质粒DNA疫苗pSVK-HBV的宿主菌。将筛选到的携带质粒pSVK-HBV的宿主菌—大肠杆菌XL10-Gold(即质粒pSVK-HBV的转化菌XL10-Gold)进行菌种保存并检测,继续传代至30代(请结合实施例2),该菌中的质粒pSVK-HBV仍然比较稳定,未发生质粒片段丢失的情况(30代的稳定性已经能够满足中试工艺的需求)。
实施例2、乙肝治疗性质粒DNA疫苗pSVK-HBV工程菌三级种子批的建立和鉴定
选取质粒含量最高和稳定性最好的转化有乙肝治疗性质粒DNA疫苗pSVK-HBV(本例以pSVK-HBVA为例)的大肠杆菌XL10-Gold(将该工程菌命名为E.coli XL10-Gold/HBV)作为原始种子,种子的培养条件为:从甘油管内取菌悬液,按照1:100 的比例接入含30mg/L硫酸卡那霉素(需要添加30mg/L的硫酸卡那霉素,作为工程菌的选择压力。由于质粒pSVK-HBV携带硫酸卡那霉素抗性基因,因此工程菌E.coli XL10-Gold/HBV为硫酸卡那霉素抗性)的LB培养基,200rpm、37℃振荡培养12h;摇瓶发酵条件为:吸取0.5mL种子发酵液至装有100mL不同发酵培养基的500mL三角烧瓶中,200rpm、37℃振荡培养15h。根据《2010版中国药典》的要求建立工程菌的三级种子批,并分别对三级种子批进行分子生物学和生化鉴定。检测项目及结果为:1.细菌形态和革兰氏染色特征,该工程菌呈典型的大肠杆菌形态,革兰氏染色为阴性(图2之A);2.菌种的生长水平检测,该工程菌在终浓度为30μg/mL硫酸卡那霉素LB培养基中能够正常生长,并能成功提取质粒(图2之B);3.菌种的生化特征,通过在半固体培养基中分别添加葡萄糖、乳糖、甘露醇等不同的糖类以及产气情况分析其生化特征为:发酵葡萄糖、甘露醇(产酸呈黄色),不发酵乳糖(未产酸无变化),不产气(无气泡)(图2之C);4.质粒大小和酶切鉴定,通过BamH Ⅰ单酶切获得了16000bp的DNA片段,通过BamH Ⅰ/BssH Ⅱ双酶切获得了10900bp和5100bp的DNA片段,与预期结果一致(图2之D);5.质粒表达的检测,通过Invitrogen公司的脂质体LipofectamineTM2000将质粒pSVK-HBV转染至293T细胞,利用FITC标记的抗人IgG FC段的抗体检测IRES(pSVK-HBV质粒中存在IRES序列)上游的HBV融合抗原的表达(由于IgG FC段与HBV抗原融合表达),利用PE标记的抗人B7.1的抗体检测IRES下游融合的GM-CSF与B7.1的表达,免疫荧光结果显示上游抗原和下游佐剂分子都能够表达(图2之E,E1为乙肝融合抗原表达,E2为佐剂分子表达,E3为明场图,E4为叠加图);6.工程菌传代稳定性的检测,将种子连续转接传代(每隔12小时)30次,分别在原代、5代、10代、15代、20代、25代、30代收菌提取质粒,进行1%琼脂糖凝胶电泳进行检测,结果显示转接传30代以后,工程菌仍然稳定(图2之F)。
实施例3、不同基础培养基对工程菌E.coli XL10-Gold/HBV生长和质粒产量(容积产率)的影响
为了找出适合工程菌E.coli XL10-Gold/HBV生长和质粒生产的培养基,将工程菌E.coli XL10-Gold/HBV在以下不同的细菌培养基中进行培养。
培养基:
LB—配方:胰蛋白胨10g,酵母提取物5g,NaCl10g,加入蒸馏水溶解,5N NaOH调节pH至7.0,定容至1000mL,高压灭菌后4℃保存备用。
TB—配方:胰蛋白胨12g,酵母提取物24g,甘油4mL,加入蒸馏水溶解,定容至900mL,高压灭菌后4℃保存备用。当溶液冷却至50℃时加入100mL无菌的0.17mol/L KH2PO4,0.72mol/L K2HPO4溶液。该溶液的配置方法是:用90mL去离子水溶解2.31g KH2PO4和12.54g K2HPO4,完全溶解后,用去离子水定容至100mL并高压灭菌20min。
M9(葡萄糖)—配方:5×M9盐溶液200mL,1mol/LMgSO42mL,20%葡萄糖溶液20mL,1mol/LCaCl20.1mL,灭菌的蒸馏水定容至1000mL。
M9(甘油)—配方:5×M9盐溶液200mL,1mol/LMgSO42mL,20%甘油溶液20mL,1mol/LCaCl20.1mL,灭菌的蒸馏水定容至1000mL。
5×M9盐溶液的配制方法:用蒸馏水溶解下列盐类,终体积为1L:Na2HPO4.7H2O64g,KHPO415g,NaCl2.5g,NH4Cl5.0g,高压灭菌后4℃保存备用。
培养方法为:吸取0.5mL工程菌E.coli XL10-Gold/HBV的种子发酵液至装有100mL不同发酵培养基的500mL三角烧瓶中,200rpm、37℃振荡培养15h。培养结束后测定质粒浓度和发酵菌体干重。菌体的干重通过分析天秤进行测定,具体操作:干燥的EP管,准确称重(G1),取大肠杆菌发酵液5mL,8000rmp离心10min,弃上清,沉淀用PBS洗涤两次,将沉淀连同离心管置于烘箱中,80℃干燥至恒重(约24h),在干燥器中冷却至室温,准确称重(G2),菌体干重为G2-G1。最终取每个发酵菌液3次平行样品测量结果的平均值。
实验结果如表1和图3所示,用LB作为基础培养能得到最高的质粒DNA产量5.5mg/L。虽然,TB培养基能得到更高的发酵菌量,但是质粒DNA的产量低于LB培养基,而M9培养基无论是发酵菌量还是质粒DNA的产量都低于LB培养基。因此,选择LB作为基础培养基,进行后续研究。
表1不同培养基对菌体生长和质粒产量的影响
实施例4、不同碳源、氮源、无机盐、微量元素以及维生素对工程菌E.coli XL10-Gold/HBV发酵和质粒DNA产量(容积产率)的影响
为生产质粒DNA疫苗pSVK-HBV的工程菌E.coli XL10-Gold/HBV筛选理想的碳源、氮源、无机盐及微量元素等,首先利用摇瓶发酵条件,从LB、TB、M9(甘油)、M9(葡萄糖)四种培养基中为工程菌E.coli XL10-Gold/HBV筛选出最佳的基础培养基—LB培养基。基础培养基筛选出之后,分别比较不同的碳源,如葡萄糖、甘油、甘露醇 等和不同氮源,如大豆蛋白胨、酪蛋白胨、眎蛋白胨、氯化铵(NH4Cl)等对工程菌生产质粒DNA pSVK-HBV的影响,确定最佳碳源和氮源以及它们的工作浓度,另外,在培养基中加入无机盐、微量元素以及维生素,以确定其对发酵和质粒产量的影响,单次单因子实验方法如下:
一、不同碳源对工程菌E.coli XL10-Gold/HBV生长和质粒DNA产量(容积产率)的影响
LB作为基础培养基,其中无碳源成分,而碳源成分对工程菌的生长以及质粒DNA的产量都有重要影响。本实验选择了甘油、葡萄糖和甘露醇作为碳源的候选对象,研究其对工程菌E.coli XL10-Gold/HBV生长和质粒DNA产量(容积产率)的影响。实验方法为:吸取0.5mL工程菌E.coli XL10-Gold/HBV的种子发酵液至装有100mL发酵培养基(配方:胰蛋白胨10g,酵母提取物5g,NaCl10g,加入碳源分别为甘油、葡萄糖和甘露醇,分别设置浓度梯度为0.5g/L、1g/L、2g/L、4g/L、8g/L、16g/L、24g/L、32g/L加入蒸馏水溶解,5N NaOH调节pH至7.0,定容至1000mL,高压灭菌后4℃保存备用)的500mL三角烧瓶中,200rpm、37℃振荡培养15h,发酵结束后测定质粒DNA浓度。
实验结果如图4所示(A-C),表明较低浓度的碳源能比较显著的提高质粒DNA产量,而碳源浓度过大不利于质粒DNA的产量,原因可能是碳源浓度高造成工程菌生长过快,而质粒DNA的复制无法与工程菌生长速度匹配,造成质粒DNA的丢失。甘油、葡萄糖、甘露醇都能作为碳源,且效果比较相似。结合实验结果,并从节省成本的角度考虑,确定使用甘油作为最终碳源,工作浓度为0.5g/L。
二、不同氮源对工程菌E.coli XL10-Gold/HBV生长和质粒DNA产量(容积产率)的影响
不同的氮源对工程菌的生长以及质粒DNA的产量有重要影响,本实验选择了大豆蛋白胨、眎蛋白胨、酪蛋白胨、氯化铵(NH4Cl)作为氮源的候选对象,替代LB培养基中的胰蛋白胨,研究这几种氮源对工程菌E.coli XL10-Gold/HBV生长和质粒DNA产量(容积产率)的影响。实验方法为:吸取0.5mL工程菌E.coli XL10-Gold/HBV的种子发酵液至装有100mL发酵培养基(配方:甘油0.5g/L,酵母提取物5g,NaCl10g,氮源分别为胰蛋白胨、大豆蛋白胨、眎蛋白胨、酪蛋白胨、氯化铵,浓度均为10g/L,加入蒸馏水溶解,5N NaOH调节pH至7.0,定容至1000mL,高压灭菌后4℃保存备用)的500mL三角烧瓶中,200rpm、37℃振荡培养15h,发酵结束后测定质粒浓度。
实验结果如图5所示,在实验的5个氮源中,眎蛋白胨作为氮源能得到最高的质 粒产量,胰蛋白胨次之,无机氮源NH4Cl质粒DNA产量最低。在此种情况下,由于胰蛋白胨为进口产品,费用较高,综合考虑成本问题,选择眎蛋白胨作为发酵培养基的氮源,工作浓度为10g/L,进行下一步实验研究,此时将培养基命名为iLB。
三、无机盐、维生素B1以及微量元素对工程菌E.coli XL10-Gold/HBV生长和质粒DNA产量(容积产率)的影响
工程菌E.coli XL10-Gold/HBV的生长除了碳源和氮源之外,还需要无机盐、微量元素及维生素等。为了考察无机盐、微量元素和维生素对于工程菌E.coli XL10-Gold/HBV生长和质粒DNA产量(容积产率)的影响,在前面筛选碳源和氮源的基础上,在发酵培养基中分别加入无机盐、微量元素和维生素,确定其对质粒DNA产量(容积产率)有无影响。实验分为四组:
iLB组:采用iLB培养基,配方:甘油0.5g/L,眎蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L,NaCl10g/L,加入蒸馏水溶解,5N NaOH调节pH至7.0,定容至1000mL,高压灭菌后4℃保存备用;
iLB+无机盐组:采用添加无机盐的iLB培养基,配方:甘油0.5g/L,眎蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L,NaCl10g/L,无机盐(Na2HPO412.8g/L+KH2PO43g/L+MgSO40.24g/L+NH4Cl1g/L),加入蒸馏水溶解,5N NaOH调节pH至7.0,定容至1000mL,高压灭菌后4℃保存备用;
iLB+无机盐+微量元素组:采用添加无机盐和微量元素的iLB培养基,配方:甘油0.5g/L,眎蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L,NaCl10g/L,无机盐(Na2HPO412.8g/L+KH2PO43g/L+MgSO40.24g/L+NH4Cl1g/L),加入蒸馏水溶解,5N NaOH调节pH至7.0,定容至1000mL,高压灭菌后4℃保存备用,使用前加入微量元素贮存液(FeCl3.6H2O27g/L,ZnCl22g/L,CoCl2.6H2O2g/L,Na2MoO4.2H2O2g/L,无水CaCl20.76g/L,CuCl2.2H2O1.27g/L,H3BO30.5g/L,溶于1.2N HCl中),浓度为1mL/L;
iLB+无机盐+微量元素+VB1组:采用添加无机盐、微量元素和维生素B1的iLB培养基,配方:甘油0.5g/L,眎蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L,NaCl10g/L,无机盐(Na2HPO412.8g/L+KH2PO43g/L+MgSO40.24g/L+NH4Cl1g/L),VB10.2g/L加入蒸馏水溶解,5N NaOH调节pH至7.0,定容至1000mL,高压灭菌后4℃保存备用,使用前加入微量元素贮存液(FeCl3.6H2O27g/L,ZnCl22g/L,CoCl2.6H2O2g/L,Na2MoO4.2H2O2g/L,无水CaCl20.76g/L,CuCl2.2H2O1.27g/L,H3BO30.5g/L,溶于1.2N HCl中),浓度为1mL/L。
实验方法为:吸取0.5mL工程菌E.coli XL10-Gold/HBV的种子发酵液至分别装有100mL上述四组培养基的500mL三角烧瓶中,200rpm、37℃振荡培养15h,发酵结束后测定质粒DNA浓度。
实验结果如图6所示,无机盐和微量元素的加入,对于质粒DNA的产量有一定的提升作用,而维生素B1基本无作用,因此用上述单次单因子法确定的培养基成分如表2所示,每1L培养基(iLB)含:眎蛋白胨10g,酵母粉5g,NaCl10g,甘油0.5g,Na2HPO412.8g,K2HPO43g,MgSO40.24g,NH4Cl1g,微量元素1mL,用水定容至1L;微量元素包括FeCl3.6H2O27g/L,ZnCl22g/L,CoCl2.6H2O2g/L,Na2MoO4.2H2O2g/L,无水CaCl20.76g/L,CuCl2.2H2O1.27g/L,H3BO30.5g/L,溶于1.2N HCl中。
表2单次单因子法确定的培养基成分
单次单因子法确定的是培养基的各种成份,然而各种成份的加入量不一定是最佳的,因此需要进一步进行各成份最佳加入量的优化,也就是下述PB设计和CCD实验。
实施例5、利用Plackett-Burman(PB)设计筛选培养基的显著影响因子
应用PB设计筛选影响工程菌E.coli XL10-Gold/HBV质粒DNA产量(容积产率)的培养基成分(显著影响因子)。将实施例4单次单因子实验中确定的LB基础培养基的9种成份作为9个变量(A、B、D、E、G、H、K、L、M)。同时,为了估计误差和验证一次方程的合理性,设计了3个虚拟变量(C、F、J)。利用Minitab设计软件设计12因素、2水平(每个因素分别分低水平“-”和高水平“+”)的21组实验。每一个变量的高、低水平和实验设计分别如表3和表4所示。PB实验设计是基于如下的一次方程:
Y=β0+ΣβiΧi
其中,Y是预测的响应值,β0是模型的截距,βi是线性系数,Χi是自变量。每组实验中质粒的产量(容积产率)进行3次检测,取3次的平均值作为响应值。利用Minitab软件对实验结果进行t检验,分析各因素的主效应,同时得到一次回归方程,选择对重组质粒产量具有显著影响的变量(p<0.01)进行进一步的优化。
表3PB试验因素与水平
表4PB试验方案
分析结果如表5和表6所示,可以看出,A、E、L这3三个因素的可信度都在 99%以上,按照重要程度排序,确定眎蛋白胨、甘油和NH4Cl这三个因素作为重要影响因子,进行下一步实验研究。同时得到一次回归方程,如下所示:
Y(mg/L)=8.12+1.42A+0.529B+0.952C+0.469D+1.34E-0.455F-0.081G+0.324H-1.07J+0.101K+1.03L-0.081M
表5PB试验因素与结果
表6PB设计确定影响质粒产量的显著影响因素
[0131]
S=0.728326 PRESS=31.1868
R-Sq=97.67% R-Sq(预测)=80.43% R-Sq(调整)=93.34%
注:“*”表示在99%置信区间内显著
实施例6、最陡爬坡实验
由于系统运行条件的初步估计常常远离实际的最优点,在这种情况下就要通过实验快速地进入到最优点的附近区域,最陡爬坡法就能很好的解决这个问题。对筛选出的重要影响因子(眎蛋白胨、甘油和NH4Cl)根据方程进行最陡爬坡设计,一次拟合方程中各变量的系数决定爬坡方向和变化步长,如系数为负,则该因素水平为递减,反之递增,系数越大变化步长越小,以坡的最高点作为后续中心组合的中心点。具体的实验设计如表7所示:
表7最陡爬坡实验设计
基于前面的一次回归方程和三个显著影响因子,来确定最陡爬坡的方向和步长。根据显著影响因子的系数为正值,确定眎蛋白胨、甘油和NH4Cl的爬坡方向都是浓度升高。实验结果如表8所示,最高的响应值在第三步达到,此时眎蛋白胨的浓度为15g/L、甘油的浓度为0.75g/L,NH4Cl浓度为2.0g/L,这个点已经逼近了最大产量响应值区域。
表8最陡爬坡实验结果
实施例7、中心组合法(CCD)确定显著影响因子的最佳浓度
根据PB实验得到的显著影响因子及最陡爬坡实验得到的中心点,采用CCD设计原理和Minitab设计软件进行响应面实验设计(见表9).对数据进行二次回归拟合,得到带交互项和平方项的响应面的回归分析模型如下:
Y=β0+ΣβiΧi+ΣβiiΧi2+ΣβijΧiΧj
其中,Y是预测的响应值,β0是模型的截距,βi是线性系数,βii是2次方系数,βij是交互项系数,Χi和Χj代表自变量。每组实验中质粒的容积产率进行3次检测,取3次的平均值作为响应值。通过Minitab的响应面回归过程进行数据分析,建立二次响应面回归模型,并进而寻求最优响应因子水平。
表9中心组合法试验因素与水平
培养基中显著影响因子的最优水平和它们之间的交互作用对质粒产量的影响,利用响应面中的中心组合法进行进一步的研究。Minitab设计软件进行响应面实验设计(见表9),根据实验结果(表10),利用多元回归分析实验资料(表11和表12),得到多元二次方程:
Y(mg/L)=12.5364+0.7447X1-0.4653X2+1.4407X3-1.3356X12-0.8530X22-0.8442X32 +0.3925X1X2+0.1000X1X3-0.6075X2X3
Y代表质粒的容积产率,X1表示蛋白胨,X2表示甘油,X3表示NH4Cl。此模型的拟合度由决定系数R2来检测,R2为94.90%,表明该模型能解释响应值变化的94.90%,拟合程度较好(表11)。二次模型方程的统计学意义由方差的F检验进行分析。模型的F值为14.47,P值小于0.01,表明该模型是有意义的。另外,失拟项F值为15.92,P值为0.06,表明失拟项和纯误差没有显著相关性(表12)。以上这些结果说明预测值和实验值能很好的拟合,表明此数学模型适合模拟工程菌E.coli XL10-Gold/HBV质粒的发酵生产。
表10CCD实验设计与结果
表11响应面二次回归方程的估计回归系数
[0155]
S=0.719381 PRESS=27.0065
R-Sq=94.90% R-Sq(预测)=61.97% R-Sq(调整)=88.34%
表12响应面二次回归方程的方差分析
为了更直观地描述3个因子对响应值的影响,做出模型的等高线和三维曲面图,如图7所示:A1和A2.甘油与眎蛋白胨的交互作用;B1和B2.NH4Cl与眎蛋白胨的交互作用;C1和C2.NH4Cl与甘油的交互作用。这些图表明了2个变量(令第3个变量水平为0)之间的交互作用。等高线的的形状是圆形或者椭圆,表明了2个变量之间的交互作用是否显著。因此,通过观察等高线的形状可以看出,X1(眎蛋白胨)和X3(NH4Cl)的交互作用最不显著,这可能是由于这两种成份分别作为有机氮源和无机氮源,质粒生产时利用的方式和途径不同。X1(眎蛋白胨)和X2(甘油)的交互作用也不显著,可能是由于眎蛋白胨中没有碳源,不能产生交互影响。X2(甘油)和X3(NH4Cl)分别作为碳源和无机氮源,甘油作为碳源主要是增加菌体量,而无机氮源提供质粒合成中的碱基成份中的氮,这种无机氮源的利用可能会更充分、更快速,随着菌体量的增长,质粒的合成也随之变化,因此,作为碳源的甘油与无机氮源NH4Cl之间存在显著的交互作用是可能的。
为了求得X1(眎蛋白胨)、X2(甘油)和X3(NH4Cl)的最佳加入浓度,分别对多 元二次回归方程的自变量求一阶偏导数(y=xn,偏导y’=nxn-1),并令其为0,得到三元一次方程组,求解该方程组,可以得到模型的极值点:X1=0.2303、X2=-0.6061、X3=1.0850,即眎蛋白胨、甘油和NH4Cl最佳浓度分别为16.5g/L、0.65g/L、3.1g/L,质粒的容积产率理论最大值为13.54mg/L,优化后的培养基成分如表13所示,每1L培养基(ILB)含:眎蛋白胨16.5g,酵母粉5g,NaCl10g,甘油0.65g,Na2HPO412.8g,K2HPO43g,MgSO40.24g,NH4Cl3.1g,微量元素1mL,用水定容至1L;微量元素包括FeCl3.6H2O27g/L,ZnCl22g/L,CoCl2.6H2O2g/L,Na2MoO4.2H2O2g/L,无水CaCl20.76g/L,CuCl2.2H2O1.27g/L,H3BO30.5g/L,溶于1.2N HCl中。为了证实预测值和真实值之间的拟合程度,以预测浓度再做3次重复验证,重组质粒的容积产率平均值为(13.18±0.43)mg/L。
表13响应面法确定的ILB培养基成份
实施例8、用工程菌E.coli XL10-Gold/HBV和高产发酵培养基制备乙肝治疗性质粒DNA疫苗pSVK-HBV及质粒DNA产量(容积产率)比较
用本发明的工程菌E.coli XL10-Gold/HBV和高产发酵培养基ILB制备乙肝治疗性质粒DNA疫苗pSVK-HBV的方法,以LB培养基作为对照,包括以下步骤;
1)种子的培养:从甘油管内取工程菌E.coli XL10-Gold/HBV菌悬液,按照1:100的比例接入含30mg/L硫酸卡那霉素(需要添加30mg/L的硫酸卡那霉素,作为工程菌的选择压力。由于质粒pSVK-HBV携带硫酸卡那霉素抗性基因,因此工程菌E.coli XL10-Gold/HBV为硫酸卡那霉素抗性)的LB培养基中,200rpm、37℃振荡培养12h,得到种子发酵液;
2)摇瓶发酵:吸取0.5mL种子发酵液至装有100mL含30mg/L硫酸卡那霉素的发酵培养基(LB、ILB)的500mL三角烧瓶中,200rpm、37℃振荡培养15h,培养结束后, 提质粒,测定质粒DNA浓度。
质粒浓度检测结果如表14所示,表明在500mL摇瓶的发酵规模下,ILB培养基发酵后质粒DNA的容积产率最高能达到13.61mg/L,是LB培养基发酵产量的2倍以上。
表14用工程菌E.coli XL10-Gold/HBV和不同发酵培养基制备乙肝治疗性质粒
DNA疫苗pSVK-HBV的质粒DNA产量(容积产率)比较结果
实施例9:用工程菌E.coli XL10-Gold/HBV和高产发酵培养基进行乙肝治疗性质粒DNA疫苗pSVK-HBV的中试发酵。
种子液的制备:从-70℃复苏一支E.coli XL10-Gold/HBV工作种子,按1:100接种于5mL的LB液体培养基中,37℃、200rpm培养12小时。按照1:100再转接于100mL的LB液体培养基中,37℃、200rpm培养12小时左右,此时得到种子液。
中试发酵:将种子液按照1:100的量种于5L发酵罐内进行发酵培养(发酵罐内含有高产发酵培养基ILB的量为3L),pH值控制在7.0±0.1,通过发酵罐自动补入H2SO4和NH3.H20来调节培养基的pH值。培养温度为37℃,溶解氧控制在30%左右,当溶解氧降低到该值时,通过补充纯氧和提高搅拌速度来调节。发酵培养6h后,按照1mL/min的流速补加高产发酵培养基ILB,总共补加500mL。发酵15小时后,结束发酵,收菌,提取质粒,测定质粒浓度。(为了确证ILB确为高产发酵培养基,用LB液体培养基作为对照,培养条件与高产发酵培养基完全一致)
对中试产品进行鉴定:用工程菌E.coli XL10-Gold/HBV和高产发酵培养基ILB进行中试发酵制备乙肝治疗性质粒DNA疫苗pSVK-HBV,质粒产量能达到180mg/L-220mg/L(容积产率),而在对照组中,LB液体培养基的质粒产量(容积产率)为100mg/L-120mg/L左右,以此确证了ILB为高产发酵培养基。
机译: 种方法,重组宿主细胞,提高产醇微生物对产醇的耐受性的方法,发酵过程中丁酸酯的压力,发酵培养基和动物饲料产品
机译: 发酵后固体载体上的生物疫苗,生物疫苗的生产方法,发酵后液体固体部分在生物疫苗载体生产中的应用
机译: 发酵后液体载体上的生物疫苗,生物疫苗的生产方法,发酵后液体部分在生产生物疫苗载体中的应用