鸡Edg受体家族基因的克隆及其在胚胎发育早期中的表达分析

摘要

Edg(endothelial differentiation gene)受体家族属于G蛋白偶联受体亚家族，介导S1P(磷脂酸鞘氨醇，sphingosine-1-phosphate)和LPA(溶血磷脂酸，sysophosphatidic acid)信号，参与细胞增殖、迁移、分化、细胞骨架重组和细胞凋亡等细胞活动调节，在血管及神经发育、生殖、移植、免疫、损伤修复、肿瘤和自身免疫性疾病等生理病理过程中发挥作用。目前在人和小鼠中已发现八个Edg受体家族成员，根据它们结合的配体分子分为SlP亚家族(S1p1/Edg1、S1p2/Edg5/H218/AGR16、S1p3/Edg3、S1p4/Edg6和S1p5/Edg8)和LPA亚家族(Lpa1/Edg2/VZG-1、Lpa2/Edg4和Lpa3/Edg7)。虽然被命名为血管内皮分化基因，但除在小鼠中已证实S1p1参与血管发育调节外，此家族其它成员在血管系统中的具体作用并不清楚，它们在小鼠以外物种中的研究更缺乏资料。 为了进一步探讨Edg受体家族的生物学功能，我们采用鸡为研究模型。鸡具有取材容易，便于观察和操作，实验周期短，经济实费等优点。我们用电子克隆的方法推导出了鸡中Edg受体家族六个成员(S1p1、S1p3、S1p、Lpa1、Lpa2和Lpa3)包含完整开放阅读框(open reading frame，ORF)的cDNA序列，并从五日龄鸡胚中扩增出了所有推导出的cDNA序列。用原位杂交的方法分析Edg受体家族成员在鸡胚发育中的表达情况，我们的结果显示：在鸡胚发育中，S1p1、S1p3和Lpa1具有限制性的表达模式，S1p4、Lpa2和Lpa3的表达微弱或广泛表达；发育中的血管、心脏、脑、鳃弓、体节、眼、肢芽等组织器官表达多个Edg受体家族成员；和小鼠比较，Edg受体家族在鸡和小鼠胚胎发育中存在一定的表达差异。本课题研究结果为以鸡为模型，研究Edg受体家族的功能和进一步比较它们在不同物种中的功能特点提供了积极数据。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：全文所用英文缩略词

声明

1前言

1.1 血管发育

1.1.1血管发育基本过程

1.1.2血管发育调控分子

1.2 Edg受体家族的发现、克隆、表达分析和功能研究

1.2.1 Slp1

1.2.2 Slp2

1.2.3 Slp3

1.2.4 Slp4

1.2.5 Slp5

1.2.6 Lpa1

1.2.7 Lpa2

1.2.8 Lpa3

1.3 Edg受体家族与血管发育

1.3.1Edg受体家族在血管系统的表达情况

1.3.2Edg受体家族在血管发育中的功能研究

1.4本课题研究的意义、目标和内容

2实验材料与方法

2.1实验材料

2.1.1菌株、质粒、引物与种蛋来源

2.1.2实验药品及试剂

2.1.2主要实验仪器及耗材

2.2.1鸡Edg受体家族基因克隆

2.2.2 Whole-mount原位杂交

2.2.3实时荧光定量PCR

3实验结果

3.1鸡Edg受体家族基因克隆

3.1.1鸡Edg受体家族含完整开放阅读框eDNA序列电子克隆

3.1.2 RNA纯度及完整性鉴定

3.1.3 PCR扩增结果

3.1.4 Edg受体家族重组质粒构建和酶切验证

3.1.5测序结果及分析

3.1.6 EST数据库检索结果

3.1.7基因组数据库检索结果

3.1.8种内及种间蛋白质同源性比较和系统发育树构建

3.2鸡Edg受体家族成员在胚胎发育中的表达分析

3.2.1 S1p1

3.2.2 S1p3

3.2.3 Slp4

3.2.4 Lpa1

3.2.5 Lpa2

3.2.6 Lpa3

4讨论

4.1鸡Edg受体家族基因克隆

4.2 Edg受体家族成员种间比较及它们在鸡中的功能分析

参考文献

附录

致谢