改良多重实时荧光PCR技术定量检测DNA甲基化

摘要

DNA甲基化作为表观遗传学的一种，在维持胚胎发育、基因印记、正常细胞功能以及人类疾病发生中起着重要作用。检测DNA甲基化对疾病特别是肿瘤进行早期诊断、预后分析、合理用药等有重要的临床意义。因此快速准确、操作简便、成本低廉的分析技术是甲基化研究及临床检测所必需的。 本文综合比较了不同的DNA甲基化检测技术的优缺点后以及在临床检测的可行性，提出了改良多重实时荧光定量PCR技术(HANDs-qMSP)，并利用该技术检测64份大肠癌标本及其正常对照的CpG岛甲基化表型(CIMP)，包括RUNX3、APC、hMLH1、Vim-29及Vim-50，利用HANDs-qMSP技术对64份大肠癌组织及64份与之对应正常对照进行临床评估，结果显示，CIMP中至少有一个基因发生甲基化的概率为85.94％(55/64)，其中RUNX3. APC、hMLH1、Vim-29及Vim-50的甲基化阳性率分别为7.81％(5/64)、15.63％(10/64)、29.69％(19/64)、65.63％(42/64)、54.69％(35/64)，特异性分别为100.00％(64/64)、98.44％(63/64)、96.88％(62/64)、90.62％(58/64)、83.74％(54/64)。与普通多重实时荧光定量PCR方法和传统的基于MethyLight发展起来的技术相比，HANDs-qMSP技术具有以下几个优点：(1) HANDs-qMSP技术设置了一份98％质控管，该质控管不仅可以作为100％阳性对照，还可作为亚硫酸盐转化效率为98％的指标，用于指示标本亚硫酸盐转化效率的高低，从而有效避免由亚硫酸盐转化效率太低所导致的假阴性结果。(2)HANDs-qMSP技术采用了同源加尾(HAND)系统，HAND系统能有效地抑制引物二聚体的产生，减小多重PCR体系中各基因间扩增效率的差异，提高相对定量的精确度。本论文所建立的HANDs-qMSP体系最低可检测到10pg/反应，且能精确定量至0.01％。同时HANDs-qMSP是多重PCR体系，在同一反应管中可同时检测分析多个基因，不仅节约了试剂和标本用量，而且使操作更加简便，减少劳动量。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写索引

声明

第一章绪论

§1.1 DNA甲基化的概述

§1.1.1 DNA甲基化和CpG岛

§1.1.2 DNA甲基化与基因关系

§1.1.3 DNA甲基化与疾病

§1.1.4 DNA甲基化在肿瘤临床诊断中的应用

§1.2 DNA甲基化的检测现状

§1.2.1基于甲基化特异结合蛋白或抗体法的方法

§1.2.2甲基化敏感限制性内切酶(MSREs)法

§1.2.3亚硫酸盐转化的方法

§1.3大肠癌早期诊断

§1.3.1大便潜血试验是最基本的检测方法

§1.3.2内镜是发现及诊断早期大肠癌的重要技术手段

§1.3.3生物标志物检测是一条新的途径

§1.4大肠癌相关基因的甲基化

§1.5本论文研究内容

第二章材料与方法

§2.1细胞系及标本来源

§2.2试验方法

§2.2.1 DNA模板的制备

§2.2.2引物和探针的设计

§2.2.3多重PCR检测体系的建立

§2.2.4 HANDs-qMSP检测体系的建立

§2.2.5对照方法MethyLight检测体系的建立

§2.3数据处理

第三章结果与分析

§3.1 HANDs-qMSP的原理

§3.2 98%质控管的制备方法

§3.3 HAND系统的基本原理

§3.4引物和探针的设计

§3.4.1特异性引物的设计

§3.4.2双链置换探针

§3.5普通多重实时荧光PCR体系的建立

§3.5.1普通多重PCR体系的优化

§3.5.2普通多重PCR体系的相对定量结果

§3.6 HANDs-qMSP检测体系的建立

§3.6.1标签的筛选

§3.6.2 HAND系统的优点

§3.6.3加尾单重PCR体系的优化

§3.6.4 HANDs-qMSP体系的优化

§3.6.5 HANDs-qMSP体系的灵敏度

§3.6.6具有校正能力HANDs-qMSP体系的相对定量能力

§3.6.7 HANDs-qMSP检测标本的典型结果

§3.6.8 64份大肠癌标本及正常对照的检测结果

§3.7 MethyLight检测体系

§3.7.1 MethyLight体系的优化

§3.7.2 MethyLight体系检测标本的典型结果

§3.7.3 MethyLight对64份大肠癌标本及正常对照的检测结果

§3.8讨论

§3.8.1 98%质控管的作用

§3.8.2采用HAND系统的优点

§3.8.3双链置换探针更适用于多重实时PCR体系

§3.8.4关于内控基因D159和ACTB

§3.8.5 CpG岛甲基化表型在临床诊断中意义

第四章结论

参考文献

附录

硕士发表交流论文

致谢