文昌鱼神经胚差减文库构建和两个胚胎发育相关基因的表达研究

摘要

文昌鱼在进化上占据重要的地位，它身体构造简单，皮肤和胚胎透明，肉眼即可观察到内部的发育情况，而且它基本躯体构成与脊椎动物相同，因此一直以来都是脊椎动物起源进化和发育机制研究的理想的模式动物。在文昌鱼胚胎发育的过程中，神经胚是一个非常关键的时期，涉及到许多重要器官的形成和组织分化，尤其是神经管的形成和体节的出现。
　　 为了筛选在这一胚胎发育阶段中起到重要调控作用的基因，我们应用抑制性差减杂交技术构建了白氏文昌鱼(Branchiostoma belcheri)神经胚差减文库，测序得到的204个EST序列去掉重复序列后进行拼接，得到了82个单独的拼接体。序列比对分析发现82个拼接体中56％与其它物种中的已知基因同源，其余的44％与已知基因没有明显的相似性，将其暂定为未鉴定基因。用RTqPCR对这些基因在原肠胚和神经胚中的差异表达进行验证，结果显示70％在神经胚阶段呈现高表达。进一步对未鉴定基因进行详细的序列分析，发现其中3个在佛罗里达文昌鱼中存在同源基因，但在其它物种中未发现有同源基因存在，因此认为它们是文昌鱼特有的基因。对这些特有基因进行深入的研究将会为文昌鱼神经胚发育的研究工作提供更多有价值的资料。
　　 在神经胚差减文库中，我们筛选到了一个脊椎动物FABP基因的同源基因-AmphiFABP，进一步应用RACE PCR扩增了该基因的cDNA全序列，并对其在不同发育时期胚胎中的表达情况进行了研究，以期弄清其与脊椎动物FABP基因家族的关系。系统进化分析表明，该基因是脊椎动物中6个FABP家族成员(H-FABP、B-FABP、E-FABP、M-FABP、A-FABP和T-FABP)共同的祖先基因。RTqPCR和原位杂交分析结果表明，在文昌鱼神经胚早期，AmphiFABP基因的表达量远高于其它时期，其表达部位主要集中在背部的神经外胚层和体节中，说明AmphiFABP基因与文昌鱼的神经管形成和体节出现相关。
　　 此外，我们还扩增了神经胚差减库中发现的文昌鱼AmphiN57基因的全长cDNA，佛罗里达文昌鱼基因组的搜索结果显示，除AmphiN57外，文昌鱼中还有另外两个与AmphiN57高度相似的基因Bf N57L和Bf N57L2，以上三种基因的蛋白都含有2个EF-hand(EFh)结构域，属于EFh钙结合蛋白超家族的成员。同源性分析发现，其它物种中不存在AmphiN57等三种基因的直系同源基因，只有NCS蛋白家族某些成员的EFh结构域与AmphiN57等三种蛋白有较低的相似性(小于20％)，结合序列比对和系统进化树的结果，推测以上三个基因由NCS家族成员倍增后特化形成，它们共同组成NCS基因家族在文昌鱼中特有的一个亚家族。时空表达分析发现，AmphiN57基因特异的在原肠胚和神经胚阶段表达，神经胚阶段其表达量急剧增加，且在中胚层、内胚层和神经外胚层都有表达，由此推测该基因可能对胚胎发育过程中的神经系统形成和胚层分化具有重要的调控作用。
　　 本研究还以日本文昌鱼(Branchiostoma japonicum)性腺cDNA为材料构建了文昌鱼雌雄性腺的差减cDNA文库。正向差减杂交以卵巢为试验方、精巢为驱动方，反向差减杂交以精巢为试验方、卵巢为驱动方，最后获得的正、反向差减文库分别含459、243个重组子。PCR扩增鉴定正、反向差减cDNA文库的插入片段，其中90％左右的克隆皆能扩增出有效产物，插入片段范围为200-600 bp，符合差减文库PCR产物片段的大小。随机选取30个阳性克隆测序分析，得到26个有效基因片段，进一步从中选取16个序列，用RTqPCR对文库质量进行验证，结果表明所建文库能够达到富集雌雄性腺差异表达基因的目的。文昌鱼性腺差减文库的构建，为进一步分离、鉴定性腺分化和发育相关基因奠定了基础。