烟草合子及二细胞原胚差减文库的构建和筛选以及相关基因的分析

摘要

高等植物的胚胎发生是个体生活史中十分重要一环，其中合子第一次非对称分裂对早期胚胎极性建立以及后续胚胎发生的影响尤为关键。尽管在拟南芥中报道了许多胚胎相关突变体分离和功能分析的工作，而且对根毛、气孔和花粉管形成过程中细胞非对称分裂和分化的调控也有较深入的研究，但是对早期胚胎特别是合子的非对称分裂和2-细胞原胚的分化调控机制的认识仍然十分欠缺。本文以模式植物烟草(Nicotiana tabacum cv.SR1)为材料，利用显微分离和合子培养技术成功获得了体内的合子和非对称分裂2-细胞原胚及其顶细胞和基细胞、体外对称分裂2-细胞原胚，结合SMART PCR cDNA合成、抑制差减杂交、斑点杂交筛选、生物信息学分析、半定量及实时定量RT-PCR、原位杂交等方法和技术，系统研究了烟草合子体内非对称分裂和体外对称分裂前后的基因表达变化，以及体内2-细胞原胚中顶细胞和基细胞转录水平上的差异，获得的主要结果如下: 1、对烟草体内合子非对称分裂和体外培养条件下合子对称分裂前后基因的表达变化在转录水平上进行了分析研究。通过手工显微操作技术分离得到了体内的合子和非对称的2-细胞原胚;利用合子体外培养体系诱导改变合子的分裂模式，获得了对称分裂的2-细胞原胚;采用SMART PCR扩增反转得到的第一链cDNA，结合抑制差减杂交技术，构建了合子和两种类型2-细胞原胚的抑制差减文库;对差减文库进行斑点杂交、筛选和克隆测序，获得了在烟草体内正常非对称分裂以及体外培养条件下对称分裂的2-细胞原胚中上调或者下调表达的1610条ESTs，对应着685个不同转录本。对这些候选基因进行生物信息学分析表明，两种分裂过程中上调或者下调表达的基因在生物学功能的GO(Gene Ontology)聚类上存在差异，特别是与刺激应答、生物学调控、物质定位和细胞形态结构形成等生物学过程相关的基因。对文库序列的同源分析表明，其中可能存在一些已知的胚胎发育、细胞极性建立以及非对称分裂相关基因的同源序列;对相关同源序列进一步的比对表明，调控细胞极性建立和非对称分裂的基因不仅在不同的植物中，甚至可能在动植物之间也存在保守性。进一步定量RT-PCR分析证实了分离候选基因的差异表达，而且部分候选基因的表达在合子或2-细胞原胚中显示出特异性。以上结果表明，我们成功地筛选并获得了合子非对称和对称分裂过程中差异表达的的转录产物，这些候选基因的分离和差异表达也说明，合子非对称分裂可能受到相关差异和特定表达基因的调控，从而启动早期胚胎发育和极性轴的建立。利用定量RT-PCR进行的组织表达检测进一步说明这些转录本可能不仅在合子分裂调控和胚胎发生过程中起作用，而且在受精、种子成熟和器官发育等过程中也发挥着重要的功能。 2、对烟草体内合子非对称分裂的产物-2-细胞原胚的顶细胞和基细胞中基因表达的差异在转录水平上进行了比较分析研究。通过条件优化，我们成功地建立了分离烟草体内2-细胞原胚顶、基细胞的方法;采用SMART PCR进行了cDNA合成，结合抑制差减杂交技术，构建了2-细胞原胚顶细胞和基细胞的抑制差减文库;对文库进行斑点杂交筛选，获得了797条差异表达的ESTs，对应着299个不同转录本;对这些候选基因进行生物信息学分析表明，顶细胞和基细胞中差异表达的基因在生物学功能分类上也存在明显差异;同源分析表明其中可能存在一些已知的胚胎发育和细胞极性建立相关基因的同源序列。通过定量RT-PCR分析，我们检测并证实了40个随机挑选的候选基因的差异表达，而且其中6个在顶细胞或基细胞中显示出特异表达。候选基因的差异表达模式随后得到了原位杂交实验结果的进一步确证。结合候选基因在合子中的定量分析表达结果，我们认为顶细胞和基细胞的表达差异的形成可能存在两种机制:差异性的转录信息遗传和细胞特异的基因激活。以上结果充分说明我们成功筛选并获得了在2-细胞原胚的顶细胞和基细胞中差异和特异表达的转录产物，这些候选基因的分离和差异表达模式也表明，合子非对称分裂之后产生的两个子细胞具有截然不同的基因表达。组织表达检测结果进一步表明，候选基因可能不仅在早期胚胎极性建立和细胞分化中起作用，而且也在胚后的个体发育过程中发挥着功能。 对烟草合子和2-细胞原胚及其顶细胞利基细胞的转录分析有效地帮助我们认识合子非对称分裂、早期胚胎顶基轴极性建立、胚胎发生以及胚后个体发育过程中相关基因的表达调控，这些候选基因的成功分离和初步分析为后续深入的基因功能研究奠定了良好的基础。

目录

声明

摘要

缩写符号

第一章前言

1．1胚胎顶-基轴极性的建立

1．2胚胎辐射轴向的建立及表皮原的形成

1．3胚根原的特化及初生根根尖分生组织的形成

1．4初生茎顶端分生组织的形成及子叶的起始

2．植物细胞非对称分裂相关研究进展

2．1胚根细胞的非对称分裂

2．2气孔细胞的非对称分裂

2．3花粉细胞的非对称分裂

3．特定细胞的转录分析研究方法

3．1特定细胞的分离技术

3．2特定细胞的转录分析技术

4．本研究的目的和意义

第二章烟草合子和非对称及对称二细胞原胚转录本的分析

1．材料和方法

1．1体内合子和非对称分裂2-细胞原胚的手工分离

1．2体外培养及对称分裂2-细胞原胚的获得

1．3细胞总RNA的分离及cDNA的合成

1．4抑制差减cDNA文库的构建

1．5抑制差减文库的克隆转化

1．6文库Macroarray点膜制备

1．7探针的制备和杂交筛选

1．8 EST序列的生物信息学分析

1．9候选基因表达的实时定量PCR验证

1．10组织和器官中基因表达的定量PCR分析

2．结果

2．1合子、非对称及对称2-细胞原胚的分离

2．2合子和2-细胞原胚抑制差减文库的构建

2．3合子和2-细胞原胚抑制差减文库的筛选

2．4合子、非对称及对称2-细胞原胚转录本的差异

2．5非对称细胞分裂和胚胎发育相关转录本的鉴定

2．6合子和2-细胞原胚中候选基因的表达

2．7不同组织和器官中候选基因的表达

3．讨论

3．1合子体内非对称分裂和体外对称分裂前后基因表达的变化

3．2体内合子非对称分裂前后差异表达基因的功能分析

3．3体外合子对称分裂前后差异表达基因的功能分析

4．本章小结

第三章烟草二细胞原胚顶细胞和基细胞转录本的分析

1．材料和方法

1．1体内2-细胞原胚顶细胞和基细胞的分离

1．2抑制差减cDNA文库构建和筛选

1．3 EST序列的生物信息学分析

1．4合子、顶细胞和基细胞中基因表达的定量PCR分析

1．5组织和器官中基因表达的定量PCR分析

1．6整体原位杂交分析

2．结果

2．1 2-细胞原胚顶细胞和基细胞的分离

2．2 2-细胞原胚顶细胞和基细胞抑制差减文库的构建

2．3 2-细胞原胚顶细胞和基细胞抑制差减文库的筛选

2．4 2-细胞原胚顶细胞和基细胞转录本的差异

2．5合子、顶细胞和基细胞中候选基因的表达

2．6合子和2-细胞原胚中候选基因的整体原位杂交

2．7不同组织和器官中候选基因的表达

3．讨论

3．1 2-细胞原胚顶细胞和基细胞的基因表达差异

3．2胚胎发生和胚后发育过程中候选基因的功能分析

4．本章小结

第四章总讨论

1．合子和早期胚胎顶-基轴极性的建立

2．2-细胞原胚中顶细胞和基细胞的命运抉择

3．合子胚胎发生过程中的信号传导及调控

参考文献

在读期间发表及投稿论文

致谢