双孢蘑菇耐热分子机理研究及相关基因的克隆与功能验证

摘要

高温胁迫(Heat stress,HS)指生物体处于超过其适宜温度范围的环境下所受到的一种非生物胁迫(Abiotic stress),它能破坏生物体正常的细胞动态平衡,导致生物体严重的生长、发育停滞,甚至死亡。随着温室效应的影响和全球变暖的趋势,高温胁迫以及与之紧密关联的干旱、渗透等胁迫已经成为导致全球性农作物减产的主要原因。本文主要研究高温胁迫对双孢蘑菇的损害,以及耐温双孢蘑菇菌株02对高温的响应和抵御机制;同时探讨了应用分子生物学和基因工程技术培育耐高温双孢蘑菇品种的可能性。
　　 双孢蘑菇[Agaricus bisporus Lange(Imbach),]是具有高经济价值和生态意义的栽培食用菌。双孢蘑菇属稳温结实性的菌株,温度是影响其生长的主要因素,因此培育种性优良的耐高温菌株是促进产业发展的根本。本课题选取同一家系内遗传背景最为接近的两株双孢蘑菇—02菌株和8213菌株8213菌株是常规栽培菌株,其只能在16-22℃下栽培,而02菌株是显著耐温菌株,其菌丝体在33℃下仍然能保持正常状态)—作为比较研究的对象,探索生物体自身对高温胁迫的响应及防御机制。通过转录组学的分析,我们构建了两个热激转录差减文库,富集了197个耐温相关的差异EST片段。经过进一步的序列比对分析和功能注释、聚类,结果显示差异基因主要为:分子伴侣类、能量及物质代谢类、信号转导类、损伤修复类等。结合双孢蘑菇热激蛋白质组学的研究结果,我们描绘了双孢蘑菇耐温菌株02自身的高温胁迫抵御网络模型。这个模型揭示了热激信号转导,核酸损伤修复,以及蛋白质修复和周转三大系统在生物体高温抵御过程的角色和协同作用,将热激后单个基因、蛋白质的表达变化与生物体系统整体的胁迫动态平衡有机联系在一起。高温抵御模型的提出不仅丰富了我们对高等真菌耐高温机制和通路的认识,而且为进一步的机理研究提供了一个清晰的提纲。
　　 在高温抵御模型及耐温基因热激时空转录谱的基础上,我们克隆了处于网络节点位置的15个重要耐温相关EST的全基因序列。我们应用逐渐完善的转基因技术,通过转基因过表达和反向遗传学抑制基因表达的方法在双孢蘑菇及模式物种拟南芥中开展耐高温表型功能验证。结果显示,有4个基因的过表达对高温敏感的双孢蘑菇8213的耐温特性起到了明显的促进作用,它们是对氨基苯甲酸合成酶基因(Pab)、脯氨酸顺反异构酶基因(Ppi)、疏水蛋白基因(Hpb)和Calnexin基因,在反向遗传学研究中,我们发现抑制疏水蛋白基因(Hab)表达起到了明显的降低02菌株耐高温特性的作用,反向的结果印证了Hab基因在促进双孢蘑菇02高温耐受性上的突出作用;拟南芥中的表型功能验证显示Pab、Ppi、Hpb以及一种免疫调节蛋白能够显著增强野生型拟南芥幼苗的基础耐温性。
　　 我们在拟南芥中研究了PABA合成酶的耐高温机制。在表型上,外源直接添加PABA(1-5μmol/L)能够直接促进拟南芥的耐温性;同时,内源过表达PABA合成酶的转基因植株(35S:AbPabase)的基础耐温性也明显优于野生型植株。通过深入研究,我们发现热激能够促进拟南芥H2O2产生,同时转基因植株(35S:AbPabase)中的本底H2O2水平显著高于野生型。此外,转基因植株(35S:AbPabase)中热休克蛋白表达水平也显著上调,这一现象同样出现在生长于外源添加PABA(5μmol/L)的野生型拟南芥小苗中。从以上结果中,我们认为在担子菌和高等植物中存在着一条“PABA-H2O2-Peroxide signaling-HSPsexpression-Thermotolerance”的信号转导通路。在这个通路里,PABA作为一个信号分子介导了H2O2累积,适量浓度的H2O2能作为第二信使,激活过氧化感受的信号转导通路,通过蛋白激酶的磷酸化作用逐渐使信号放大,信号入核促进了热休克蛋白和耐高温相关的功能基因的过表达,最终提高了生物体的耐温性。PABA信号通路的提出不仅丰富了我们对耐高温信号转导的认识,而且它也是对水杨酸信号通路最有力的支持和补充。