慢病毒基因载体系统的拓展应用性研究

摘要

慢病毒载体因为具有能感染分裂和未分裂的宿主细胞,并且带给宿主细胞轻微的免疫原性的优点,而在转基因改造、基因功能分析和基因治疗中得到了广泛的应用。但是,慢病毒载体的整合特性,尤其是它整合到基因组的转录活性区域或邻近活性区域的特性,使基因功能分析的结果产生未知干扰,并给实际应用带来风险。慢病毒的整合可能会引起突变,或者改变非目的基因的表达从而对目的基因的功能研究产生影响,而且病毒序列整合到宿主细胞基因组中可能会在转基因操作中带来长期和有害的影响。我们的研究旨在利用慢病毒的优良特性的同时,通过其他的改进措施来解决慢病毒整合带来的消极影响,拓展慢病毒的应用性。
　　 为了避免插入突变的风险,我们对慢病毒包装系统的pMDLg/pRRE载体上的整合酶中的5个氨基酸位点进行定点错义突变,并对慢病毒载体相关部件和包装技术进行优化。获得了IDLV-D64A、IDLV-D116A、IDIN-R262A-R263AK264H、IDLN-D64A-D116A、IDLV-D64A-D116A-R262A-R263A-K264H五种整合酶缺陷的慢病毒,通过对这5种慢病毒的包装效率、整合酶缺陷慢病毒所介导的外源基因表达能力、残留整合酶活性、整合缺陷形成的2LTR与慢病毒基因组的比率以及介导外源基因表达能力的持续性的比较,综合分析其应用的可行性和安全性。我们发现整合酶上这些位点的突变并没有协同效应或相加效应,而IDLV-D64A病毒可有效用于基因功能分析和基因治疗。
　　 目前,对于小鼠等少数胚胎干细胞技术成熟的模式动物,可以通过同源重组技术获得稳定的基因改造;对于多数的其他动物,还需要依赖慢病毒整合来获得稳定的转基因细胞和转基因动物,需要利用Cre酶切除整入基因组的病毒序列残存来消除转基因的安全隐患。Cre酶定位切除还在小鼠的条件性基因敲除中广泛应用。为了对Cre酶的表达和发挥功能的情况进行定位和监视,我们构建了由CMV驱动的Cre重组酶和荧光蛋白联合表达的慢病毒载体。该载体中Cre重组酶与绿色/红色荧光蛋白通过口蹄疫病毒的2A序列藕联,我们发现这种改建不影响病毒的包装和感染以及Cre的功能活性,而荧光报告却精准有效。在载体病毒中我们还引入了突变型LoxP中重组活性很高的位点Lox5171,将两组LoxP位点同向置于一个慢病毒载体中,借助Cre酶的剪切能将残留病毒片段最小化。这些改建提供了利用慢病毒整合获得安全转基因的改进方案。
　　 有报道指出细胞内Rad51和Ku70蛋白含量的改变能大大提高细胞的基因打靶效率,但也有资料指出Rad51和Ku70蛋白与细胞凋亡密切相关。对于在提高基因打靶效率中,改变这两种蛋白含量对细胞凋亡所产生的影响尚不清楚。我们首先通过双分子荧光互补技术(BiFc)对细胞的Rad51与p53、Ku70与Bax两组蛋白之间的相互作用进行了研究,研究结果表明Rad51与p53、Ku70与Bax之间都有相互作用。在鸡DF-1细胞中对Rad51蛋白过量表达或Ku70基因的表达进行有效干扰后,用流式细胞技术和Tunel对DF-1细胞凋亡情况进行检测,我们发现:在没有凋亡胁迫时,这两种蛋白的含量变化对DF-1细胞凋亡的影响很小;但Rad51和Ku70的过量表达能阻抑DF-1细胞在STS诱导下的细胞凋亡,而Ku70的干扰则促进细胞在STS诱导下的DF-1细胞凋亡,Rad51能在一定程度上减弱Ku70干扰引起的DF-1细胞凋亡作用。与Rad51相似,过表达能促进p53蛋白进行泛素化降解的Mdm2蛋白也能一定程度上抑制STS对DF-1细胞的凋亡诱导作用。已有的资料表明P53的蛋白修饰对于Bax的转录是必需的,但我们的Western结果显示:尽管Rad5的过表达能增加其与P53蛋白结合,但Bax含量却没出现预期的变化,表明Rad51蛋白并没有参与Bax基因表达的调节,它对DF-1细胞凋亡的阻抑可能主要通过它的DNA修复功能而起作用。这些结果表明,这些基因参与的细胞凋亡中的作用在哺乳动物和其它脊椎动物中具有普遍性,Rad51的过表达和Ku70的有效干扰可用于提高细胞的基因打靶效率,且并不会因为它们干扰细胞凋亡而造成明显的不利影响。