广州管圆线虫钙网蛋白、14-3-3蛋白基因克隆、序列分析及免疫原性反应

摘要

钙网蛋白(Calreticulin)是一种多功能蛋白，其功能包括Ca2+储存与信号转导、糖蛋白凝集素样分子伴侣、基因表达调节、细胞黏附和自身免疫等。最近不少研究发现，钙网蛋白与寄生虫（包括盘尾丝虫属、血吸虫属、利什曼原虫属、疟原虫属和板口线虫属等）感染免疫有密切关系。
　　 14-3-3是一蛋白家族，其成员为一系列广泛表达并高度保守的酸性蛋白，它们可以自发形成可结合磷酸化丝氨酸/苏氨酸位点的二聚体，该蛋白在真核细胞细胞信号活动中起到关键作用。在一些寄生虫中，人们己纯化得到14-3-3蛋白并对其特性进行了研究。
　　 我们以广州管圆线虫为材料，在分析生物信息数据库中积累的大量钙网蛋白同源性序列的基础上，设计简并引物，利用RT-PCR方法从广州管圆线虫cDNA中扩增出约340bp的片段，然后结合RACE技术获取全长序列，克隆广州管圆线虫钙网蛋白基因的全长。同时以广州管圆线虫为材料，在分析生物信息数据库中广州管圆线虫14-3-3蛋白基因EST序列的基础上，设计特异引物，利用RT-PCR方法并结合RACE技术获取全长序列，克隆广州管圆线虫14-3-3蛋白基因的全长。利用NCBI，signalP等多种在线分析软件预测其钙网蛋白和14-3-3蛋白的结构及进行功能分析。钙网蛋白表达部分用SalⅠ和XhoⅠ双酶切，并连入表达载体pET32a(+)。经SalⅠ和XhoⅠ双酶切和测序鉴定，将构建的原核表达质粒pET32a(+)-AcCRT转入大肠埃希菌BL21(DE3)中进行表达并纯化。结果表明该基因全长1497bp，编码401个氨基酸，表达蛋白纯化后在62KD附近得到单一蛋白带。成功克隆并表达纯化钙网蛋白后进一步研究该蛋白的抗原性，为其功能的研究做基础。14-3-3蛋白表达部分用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切，并连入表达载体pET32a(+)。经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切和测序鉴定，构建的原核表达质粒pET32a(+)-Ac14-3-3转入大肠埃希菌BL21(DE3)中进行表达并纯化。结果表明该基因全长949bp，编码251个氨基酸，表达蛋白纯化后在45KD附近得到单一蛋白带。成功克隆并表达纯化14-3-3蛋白后进一步研究该蛋白的抗原性，为其功能的研究做基础。