绞股蓝总皂苷及其微生物转化产物的制备与生物活性研究

摘要

绞股蓝[Gynostemma pentaphyllum(Thunb) Makino]为葫芦科多年生落叶草质宿根藤本植物，是目前已知的除五加科植物人参属以外，唯一含有人参皂苷类成分的植物。大量研究表明，绞股蓝皂苷在抗氧化、抗炎、抗癌、改善免疫力等方面都表现出较高活性，因此绞股蓝一直都是研究开发中备受关注的药用植物。
　　本论文是从绞股蓝中提取绞股蓝总皂苷，通过微生物转化，切除绞股蓝皂苷侧链的糖苷，从而获得经过微生物代谢后的次级绞股蓝皂苷。并比较研究转化前后绞股蓝总皂苷的生物学效应。主要研究内容及结果如下:
　　比较水浴加热提取与超声提取两种方法对绞股蓝总皂苷提取效率的影响，结果表明超声法提取率高于水浴加热提取率。结合上述实验结果，正交实验优化超声法的最佳提取条件为90％乙醇，料液比为1∶20，提取时间为50min。
　　通过静态吸附和动态洗脱研究比较了大孔吸附树脂D101、HP-20、DM130及AB-8对绞股蓝总皂苷的富集纯化效果。结果表明DM130大孔吸附树脂对绞股蓝总皂苷的富集纯化效果最佳。以乙醇作为洗脱剂，对于动态洗脱方法最佳的乙醇体积分数为70％。
　　以硅胶和聚酰胺为层析柱的填料，薄层层析跟踪检测，对转化前绞股蓝总皂苷进行柱层析分离，获得50.4mg皂苷化合物GYP-C1，分子量为1093.6和18.4mg的皂苷化合物GYP-C2，分子量961.5。并通过NMR鉴定出这两种化合物的结构，发现GYP-C1可能是尚未发现的皂苷化合物。GYP-C2为2-羟基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖-20(S)-原人参二醇-20-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。
　　以灰绿曲霉和青霉菌分别转化福建南靖绞股蓝总皂苷，HPLC检测比较转化前后的绞股蓝总皂苷成分的变化，结果表明经两种菌株分别转化后，在总皂苷中分别产生了不同于转化前的皂苷成分。
　　通过本实验室建立的酪氨酸酶活性测定方法测定转化前后的总皂苷对酪氨酸酶的抑制活性，结果发现转化前的绞股蓝总皂苷对酪氨酸酶具有抑制作用，使酶活力下降一半时的浓度(IC50)为0.15mg/mL。DPPH自由基清除实验、DNA氧化性损伤实验及铁离子还原力的测定表明转化前后的皂苷都具有良好的抗氧化能力。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 绞股蓝研究概况

1．1．1 绞股蓝简介

1．1．2 绞股蓝化学成分的研究概况

1．2 绞股蓝的药理研究概况

1．2．1 绞股蓝提取物对脂质代谢的影响

1．2．2 绞股蓝对心血管疾病的影响

1．2．3 绞股蓝对脏器的保护作用

1．2．4 绞股蓝的抗癌作用

1．2．5 绞股蓝对免疫系统的调节作用

1．2．6 绞股蓝的其他活性

1．3 生物转化皂苷的研究概况

2 实验材料及方法

2．1 材料与仪器

2．1．1 实验材料

2．1．2 主要实验仪器

2．1．3 药品及试剂

2．2 常用试剂及培养基的配制

2．2．1 常用试剂的配制

2．2．2 培养基的配制

2．3 论文研究路线

2．4 实验方法

2．4．1 绞股蓝总皂苷含量的测定方法

2．4．2 绞股蓝总皂苷提取方法的选择

2．4．3 绞股蓝总皂苷的萃取纯化

2．4．4 超声波辅助提取绞股蓝皂苷条件的优化

2．4．5 高效液相色谱分析绞股蓝总皂苷

2．4．6 大孔吸附树脂的预处理

2．4．7 饱和吸附条件下吸附纯化绞股蓝总皂苷能力的研究

2．4．8 不饱和吸附条件下吸附纯化绞股蓝总皂苷能力的研究

2．4．9 洗脱溶剂的浓度选择

2．4．10 柱层析分离福建南靖绞股蓝总皂苷

2．4．11 绞股蓝皂苷的结构鉴定

2．4．12 微生物转化福建南靖绞股蓝总皂苷

2．4．12 皂苷效应物对酪氨酸酶抑制机理的测定

2．4．13 皂苷效应物的抗氧化作用测定

3 实验结果

3．1 绞股蓝总皂苷含量的测定

3．1．1 皂苷含量测定标准曲线

3．1．2 不同产地的绞股蓝总皂苷含量

3．2 绞股蓝总皂苷的提取方法及条件优化

3．2．1 提取方法的选择

3．2．2 超声波辅助提取条件的优化

3．3 绞股蓝总皂苷的HPLC分析

3．4 大孔吸附树脂纯化股蓝总皂苷

3．4．1 四种大孔吸附树脂纯化能力的比较测定

3．4．2 洗脱溶剂的浓度的选择

3．5 绞股蓝总皂苷的分离

3．5．1 TLC及HPLC检测结果

3．5．2 质谱分析结果

3．5．3 GYP-C1的NMR图谱及结构解析

3．5．4 GYP-C2的NMR图谱及结构解析

3．6 福建南靖绞股蓝总皂苷的转化结果

3．6．1 转化菌株的活化

3．6．2 HPLC检测转化结果

3．7 皂苷效应物对酪氨酸酶的效应

3．7．1 皂苷效应物对酪氨酸酶活力的影响

3．7．2 皂苷效应物对酪氨酸酶抑制机理的判断

3．7．3 皂苷效应物对酪氨酸酶抑制类型和抑制常数的判断

3．8 皂苷效应物的抗氧化作用测定

3．8．1 皂苷效应物对DPPH自由基清除能力的测定

3．8．2 皂苷效应物对Fe还原能力的测定

3．8．3 皂苷效应物对DNA氧化性损伤的保护作用测定

4 讨论与展望

4．1 结果讨论

4．1．1 绞股蓝总皂苷含量的测定及HPLC分析

4．1．2 绞股蓝总皂苷的提取方法

4．1．3 绞股蓝总皂苷的富集纯化

4．1．4 单体皂苷化合物的分离纯化及结构鉴定

4．1．5 微生物转化绞股蓝总皂苷

4．1．6 绞股蓝总皂苷的生物学效应

4．2 展望

缩略语对照表

参考文献

已发表论文

致谢