拟穴青蟹蜕皮抑制激素与甲壳动物高血糖激素基因的克隆与表达分析

摘要

眼柄神经节的X器官-窦腺复合体(X-organ-sinus gland，XO-SG)是甲壳动物神经内分泌调控中心，主要分泌四种激素:蜕皮抑制激素(Molt-inhibiting hormone，MIH)、甲壳动物高血糖激素(Crustacean hyperglycemic hormone，CHH)、性腺抑制激素(Gonad-inhibiting hormone，GIH)、大颚器官抑制激素(Mandubular organinhibiting hormone，MOIH)。由于这一组神经肽的一级结构与CHH许多相同之处，它们就被统称作CHH家族神经激素(Crustacean hyperglycemic hormone，CHH)。MIH属于CHH家族Ⅱ型神经肽，对甲壳动物蜕皮有着明显的抑制作用。CHH属于CHH家族Ⅰ型神经肽，主要调控着甲壳动物体内的血糖水平，维持着各个组织与器官的能量供应，参与渗透压调节等作用。拟穴青蟹(Scylla paramamosain)是我国重要的海水养殖蟹类。本文采用分子生物学等方法对拟穴青蟹MIH和CHH基因开展了克隆与表达的研究。主要结果如下:
　　 1)拟穴青蟹蜕皮抑制激素基因(Sp-MIH)的cDNA全长1226 bp，开放阅读框为342 bp，编码一个由113个氨基酸组成的多肽，其中包括35个氨基酸组成的信号肽和78个氨基酸组成的成熟肽。Sp-MIH基因由2个内含子和3个外显子组成。同源性分析表明Sp-MIH在结构上较为保守，与其他甲壳动物同源性很高。系统发育分析结果也表明Sp-MIH能与甲壳动物短尾类聚为一束。实时定量PCR结果显示，Sp-MIH分布于眼柄神经节和脑中，且在眼柄神经节中高表达，在非神经组织器官中几乎不表达。检测不同蜕皮期的眼柄神经节，发现Sp-MIH mRNA的表达水平自蜕皮后期至蜕皮间期显著增加，然后迅速降低，至蜕皮晚前期达到最低，表达量仅为蜕皮后期的一半，该变化与MIH抑制蜕皮的生理功能相符。在不同卵巢发育期的神经组织器官（眼柄神经节、脑）中，Sp-MIH水平在卵黄发生前期持续升高，待卵黄发生后表达水平有所下降，但仍保持一定量来调控卵巢发育，表明MIH可能参与初级卵黄发生的调控。
　　 2)拟穴青蟹甲壳动物高血糖激素基因克隆获得两种异构体(Sp-CHH1和Sp-CHH2)。Sp-CHH1的cDNA全长1722 bp，开放阅读框为426 bp，编码141个氨基酸，其中包括27个氨基酸组成的信号肽，37个氨基酸组成的CHH前体相关肽(CPRP)，KR位点和75的氨基酸组成的成熟肽。Sp-CHH2的cDNA全长1841 bp，开放阅读框420 bp编码139个氨基酸，其中包括27个氨基酸组成的信号肽，37个氨基酸组成的CHH前体相关肽(CPRP)，KR位点和73的氨基酸组成的成熟肽。Sp-CHH1和Sp-CHH2有相同的信号肽和CPRP，不同之处在于成熟肽。两个异构体成熟肽前40个氨基酸是一致的，在成熟肽第41个氨基酸处出现明显差异。CHH基因克隆得到1个内含子和2个外显子，并发现一个微卫星位点。同源性分析表明Sp-CHH在结构上较为保守，与其他甲壳动物同源性很高。系统发育分析结果表明Sp-CHH能与甲壳动物短尾类聚为一束。采用实时定量PCR方法分析，结果显示Sp-CHH在眼柄神经节、脑、胸神经团、胃、肝胰腺、心脏、肌肉7个组织中表达，在眼柄神经节内表达最高。检测眼柄神经节，发现Sp-CHH在不同蜕皮期的表达趋势与Sp-MIH相似，提示CHH也可能具有抑制Y器官分泌蜕皮激素的功能。对卵巢发育不同期眼柄神经节进行检测，发现Sp-CHH在成熟之前表达量持续增长，提示卵巢发育需要高表达量CHH的参与。眼柄神经节Sp-CHH原位杂交表明，Sp-CHH主要分布在X器官中，杂交信号强，且主要分布于神经分泌细胞的细胞质内，这与其他甲壳动物免疫组化的研究结果一致。
　　 综上所述，本研究从分子水平上对Sp-MIH和Sp-CHH的结构及功能进行探讨，该研究可以丰富和充实青蟹内分泌生理的理论基础，还可为青蟹养殖技术的创新提供理论支撑，具有较重要的理论意义和潜在的应用价值。

目录

声明

缩略词中英文对照表

摘要

第一章 前言

1．1 甲壳动物的眼柄神经激素简介

1．2 蜕皮抑制激素(MIH)研究概况

1．2．1 MIH的结构与功能

1．2．2 MIH的调控通路

1．3 甲壳动物高血糖激素(CHH)研究概况

1．3．1 CHH的结构和功能

1．3．2 CHH的调控机制

1．4 研究目的和意义

第二章 拟穴青蟹MIH的分子克隆及表达分析

2．1 拟穴青蟹MIH的cDNA及gDNA克隆

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验方法

2．1．3 结果与讨论

2．1．4 小结

2．2 拟穴青蟹MIH基因的相对实时定量表达

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验方法

2．2．3 结果与讨论

2．2．4 小结

第三章 拟穴青蟹CHH的分子克隆及表达分析

3．1 拟穴青蟹CHH的cDNA及gDNA克隆

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验方法

3．1．3 结果与讨论

3．1．4 小结

3．2 拟穴青蟹CHH基因的相对实时定量表达

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验方法

3．2．3 结果与讨论

3．2．4 小结

3．3 拟穴青蟹CHH的原位杂交定位

3．3．1 实验材料

3．3．2 实验方法

3．3．3 结果与讨论

3．3．4 小结

第四章 总结与展望

4．1 总结

4．2 创新点

4．3 展望

参考文献

在学期间参与的科研项目及成果

致谢