青虾蜕皮抑制激素基因及其在加速青虾蜕皮和生长中的应用

摘要

本发明公开了一种青虾蜕皮抑制激素基因及其在加速青虾蜕皮和生长中的应用，青虾蜕皮抑制激素基因，其核酸序列如SEQIDNO:1所示。利用RNA干扰技术，根据青虾蜕皮抑制激素基因序列的开放阅读框设计RNA干扰引物，然后以青虾总cDNA为模板进行PCR扩增，得到序列如SEQIDNO:4所示，以SEQIDNO:4进行体外转录合成dsRNA，将dsRNA注射到青虾的围心腔后，加速青虾蜕皮和生长。利用RNAi的方法对青虾的损伤小，不影响其正常的采食、栖息及交配，便于进行长期的研究，且作用效果显著。本发明为调控青虾生长发育，培育青虾优良品种提供新的思路和有效手段。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术和发育调控领域，具体涉及一种青虾蜕皮抑制激素基因及其在加速青虾蜕皮和生长中的应用。

背景技术

青虾，学名日本沼虾(Macrobrachium nipponense)，俗称河虾，隶属十足目（Decapoda）、长臂虾科（Palaemonidae）、沼虾属（Macrobrachium），广泛分布于我国各地水域，生长快、适应性强、养殖经济效益高，是我国重要的淡水养殖虾类。据2012年《中国渔业年鉴》记载，全国养殖青虾年产量超过23.7万吨，年产值超过150亿元，青虾养殖已在我国水产养殖中发挥了举足轻重的作用。近年来，随着规模化养殖的不断扩大和消费需求的不断提高，培育出性状更加优良的新品种是当前青虾遗传育种的关键。

蜕皮抑制激素（molt-inhibting hormone，MIH）,是甲壳动物眼柄中合成分泌的甲壳动物高血糖激素（crustacean hyperglycemic hormone，CHH）家族中一种重要的神经肽，具有调控甲壳动物蜕皮、发育活动的作用。在甲壳动物中的多项研究发现，蜕皮抑制激素能够抑制甲壳动物的蜕皮的发生，是甲壳动物生殖和发育调控中一种重要激素。

RNAi（RNA interference, RNAi）技术是一种由双链RNA诱发的基因沉默技术。在细胞内能特异性地诱导与之同源互补的mRNA的降解，使相应基因的表达关闭。RNAi被认为是在基因功能研究中最有效的方法之一，已成为甲壳动物重要基因的功能的研究等很多领域中的重要工具。然而目前，在青虾重要基因研究中的应用尚未有报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种青虾蜕皮抑制激素基因及其在加速青虾蜕皮和生长中的应用。利用本发明提供的青虾蜕皮抑制激素基因设计合成的dsRNA，可以有效的加速青虾蜕皮的发生从而加速青虾的生长和发育，为培育发育快、生长好的青虾优良品种提供新的思路和有效手段。

青虾蜕皮抑制激素基因，其核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

所述青虾蜕皮抑制激素基因在加速青虾蜕皮和生长中的应用。

所述的应用，是利用RNA干扰技术，根据青虾蜕皮抑制激素基因序列的开放阅读框设计RNA干扰引物，然后以青虾总cDNA为模板进行PCR扩增，得到序列如SEQ ID NO:4所示，以SEQ ID NO:4进行体外转录合成dsRNA，将dsRNA注射到青虾的围心腔后，加速青虾蜕皮和生长。

所述RNA干扰引物的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示。

dsRNA是用上游引物SEQ ID NO:2和下游引物SEQ ID NO:3通过PCR扩增得到的PCR产物SEQ ID NO:4经纯化后，进行体外转录合成得到的。

将dsRNA注射到青虾的围心腔的注射剂量为每克体重注射2~6μg dsRNA，优选为每克体重注射4μg dsRNA。

应用的具体步骤如下：

首先根据青虾蜕皮抑制激素基因（MIH基因）序列SEQ ID NO:1，在其开放阅读框内设计RNA干扰引物，并在上述引物前添加T7启动子序列（TAATACGACTCACTATAGGG），确定上游引物SEQ ID NO:2和下游引物SEQ ID NO:3，序列分别为：TAATACGACTCACTATAGGGGTAAACCTGACAGCGCAAGG

、TAATACGACTCACTATAGGGCCATCTGTTGAGCTGTTCCA（下划线为T7启动子序列）。

用上述含有T7启动子的上游引物SEQ ID NO:2和下游引物SEQ ID NO:3通过PCR扩增得到PCR产物（序列如 SEQ ID NO:4所示），经纯化后按照Transcript AidTM T7 High Yield Transcription kit (Fermentas, Inc., USA)试剂盒说明进行体外转录合成dsRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

dsRNA在青虾蜕皮发育中的应用：注射上述dsRNA分别到同期发育的雌性和雄虾青虾的围心腔后在六周内进行连续观察和数据统计。结果表明：dsRNA可以特异性的沉默MIH基因mRNA表达，并能显著的加速雌雄青虾蜕皮的发生和雄虾体重的增加。

有益效果：退皮是决定青虾的生长和生殖的关键因素，目前用于加速青虾蜕皮和生长发育的主要方法是通过眼柄摘除实现的。然而，眼柄摘除对青虾造成的机械损伤很大，尤其是幼虾，常常造成高死亡率。利用RNAi的方法对青虾的损伤小，不影响其正常的采食、栖息及交配，便于进行长期的研究，且作用效果显著。

附图说明

图1. 成体青虾注射dsRNA后，眼柄中MIH基因在不同采样点时间的mRNA表达量，青虾β-Actin基因作为内参基因。2，4, 6, 8, 10,12分别为注射后2天，4天，6天，8天,10天和12天(N = 3)。**P < 0.01。对照组注射相同剂量的DEPC水。

图2. 连续性RNAi期间青虾蜕皮频次(a)和体重(b)的变化的直观图。其中：组1，组2，组3，组4分别为雄虾干扰组、雄虾对照组、雌虾干扰组、雌虾对照组对照组注射相同剂量的DEPC水。

具体实施方式

实施例1：青虾MIH基因全长cDNA的获得

    总RNA提取:选取成熟青虾两只，无菌解剖剪摘除眼柄组织，在RNA保存液(TaKaRa Bio Inc. Japan)中进行将眼柄色素部分夹破、漂洗预处理后进行青虾眼柄总RNA提取，具体操作步骤参照Takara Trizol试剂盒。

第一链cDNA合成：以上述总RNA，参照Takara M-MLV反转录试剂盒反转录之后得到第一链cDNA。

青虾MIH基因全长cDNA的获得:

依据罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii, KC990939.1)MIH cDNA的保守区域，设计两对中间引物，见SEQ ID NO: 6~9，

（ middle F1：5′-CCGGCATTCCTTTGTTTACCTG-3,  middle R1：5′-ATATTCTGGCGTGTGGTCCTG-3′;

middleF2:5′-CCTGAGTGTCTGTCCAGTTTGA-3′, middle R2:5′-TGGTCCTGGAGCTTATTTTAGAGG-3′），以上述第一链cDNA为模板进行中间片段的克隆，进行PCR扩增反应体系如下：

RT液2 μL10×PCR Buffer2.5 μLMgCl₂(25mM)2 μLdNTP Mixture(25mM each)0.2 μLForward Primer(10μM)1 μLReverse Primer(10μM)1 μLTaq DNA Polymerse(5U/μL)0.2 μLdH₂Oup to 25 μL

PCR反应程序为：94℃预变性3min，然后进入下列循环：94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，30个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。

利用上海生工生物工程有限公司(Sangon)的柱式DNA 胶回收试剂盒进行目的片段的回收，将产物连接到pMD18-T载体（Takara），并转化入大肠杆菌DH5α，进行蓝白斑筛选，挑取单克隆白斑扩增培养后，将插入目的片段的阳性克隆送至上海铂尚生物公司进行测序分析，得到青虾MIH基因cDNA的中间片段。 

根据得到的青虾MIH基因cDNA的中间片段序列，利用RACE技术扩增3′端、5′端，操作步骤按TaKaRa 3’-RACE和TaKaRa5’-RACE试剂盒说明书进行。PCR产物经切胶回收、纯化、克隆、测序，然后和已获得的青虾MIH基因cDNA的中间片段进行拼接后获得青虾MIH基因全长cDNA序列，如SEQ ID NO:1所示。

 实施例2：青虾MIH基因的dsRNA的获得

根据已克隆获得的青虾MIH基因（Accession number： KF878973），采用NCBI在线序列分析软件（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）确定MIH基因的开放阅读框位置为436-795bp。根据上述结果，采用在线dsRNA引物设计软件（http://www.flyrnai.org/cgi-bin/RNAi_find_primers.pl），在青虾MIH开放阅读框内设计dsRNA引物，并在每条引物前面添加T7启动子序列5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’，组成dsRNA合成引物，其引物序列分别为上游引物SEQ ID NO:2和下游引物SEQ ID NO:3。所有引物均在铂尚生物技术（上海）有限公司合成。

采用上述青虾dsRNA引物在青虾总cDNA上进行PCR扩增（条件同实施例1），获得SEQ ID NO:4，经过生工生物工程（上海）股份有限公司的SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒纯化后，按照TranscriptAid^TM T7 High Yield Transcription kit (Fermentas, Inc., USA)试剂盒说明进行体外转录合成dsRNA，序列如SEQ ID NO:5所示。dsRNA浓度采用BioPhotometer (Eppendorf, Hamburg, Germany)在260 nm进行测定，并调节终浓度为4μg/μl。

实施例3：注射青虾MIH基因的dsRNA对青虾蜕皮发育的影响

1. 试验用虾的选择

为研究dsMIH基因的沉默效果，本研究首先进行一次性RNAi实验挑选活力较强，个体均匀，体重在1.50±0.35g左右的成体雌虾50只，平均分成两组，一组为注射dsRNA组，另一组为注射DEPC水组（对照组）。实验前在500L的聚乙烯塑料白色桶中充气暂养72 h，使其适应实验室养殖环境，每天早晚各投喂1次螺蛳。

根据一次性RNAi实验的结果设计连续性RNAi实验，连续性RNAi实验所用虾是由本实验室孵化的同一批次出膜的幼虾，在体式显微镜下辨别雌雄，挑选体重在0.60±0.25g左右的雌、雄虾各30只，分为四组 (n=15)：雄虾干扰组和雌虾干扰组注射dsRNA；两个对照组注射等量的DEPC水。实验在冬季11~12月份进行，实验前两周将水温逐步升至25 ℃，使其适应该温度，每天早晚各投喂1次螺蛳。

2.青虾MIH基因的dsRNA的注射和检测

根据每克体重注射4μg dsRNA的剂量，以内径为1.2mm的毛细管尖端拉细作为注射针，将dsRNA溶液从青虾头胸甲基部注入围心腔内，对照组注射DEPC水。一次性RNAi实验的采样分别于注射后第2天、第4天、第6天、第8天、第10天和第12天，每个采样点设计3个生物重复，采集眼柄组织在RNA保存液中进行预处理后用于RNA的提取。连续性RNAi每隔7天对各组虾进行一次相同物质、相同剂量补注，整个过程持续6周时间。实验过程中每天对各组中蜕皮虾进行统计，实验前和实验结束时分别对各组虾的体重进行测量并记录，结果见图1和表1。

表1. 处于同一发育时期的雌、雄青虾连续六周注射dsRNA后统计的青虾蜕皮频次和体重的变化。

组别变量雄虾干扰组雄虾对照组雌虾干扰组雌虾对照组蜕皮频次(次数)172125体重增加量(g)0.260.060.080.04

 3. 青虾MIH基因沉默效率的检测

提取各样品的总RNA并反转成cDNA，采用Real Time PCR检测MIH基因相对于内参基因（青虾β-Actin）的表达量，以计算MIH基因沉默的效率。

4. 青虾MIH基因dsRNA对青虾蜕皮和体重的影响

实验过程中每天对各组中蜕皮虾进行统计，实验前和实验结束时分别对各组虾的体重进行测量，记录并进行统计分析。

5. 结果分析 

如图1所示，相对于对照组，注射后第2天，青虾MIH基因的表达量显著下降了61%，在第6天下降了93%，在第8天下降了91%。在第10天和第12天分别下降了67%和62%。

如表1和图2所示，在进行连续性RNAi期间，处理组和对照组的蜕皮频次出现显著差异，处理组的蜕皮频次显著高于对照组。在六周内，实验组的雄虾和雌虾分别有17次、12次蜕皮记录，而相应的对照组仅为2次、5次。实验组雄虾体重平均增加0.26g，与实验前相比增加显著(P<0.05)，而其他三组实验前后体重增加不显著。

由以上结果可知，与对照组相比，以每克体重注射4μg的dsRNA的剂量，一次注射青虾MIH基因的dsRNA后，青虾MIH基因的表达量显著下降，在第6天时干扰效果达到最大，该干扰作用持续时间长，第12天时差异仍显著。本实验研究结果表明，本发明提供的青虾蜕皮抑制激素基因的dsRNA可以有效的加速雌、雄青虾的蜕皮频次，且对雄虾体重的增加效果显著。为培育青虾性状优良品种提供新的思路和有效手段。

                         序列表

 

<110>  中国水产科学研究院淡水渔业研究中心

 

<120>  青虾蜕皮抑制激素基因及其在加速青虾蜕皮和生长中的应用

 

<130> 

 

<160>  9    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  925

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

tcgatggaaa gtaaactttc ctctgccgca gagcacgacg caaggacgag cgagtatacc     60

 

tgagccgtgc atttcgaagg cactgcttgg agaaaccttt ctctagacta atacgccacc    120

 

gcacgttcct ccctctccct ccctccctct ctctctctct ctttttctct tttgctcgct    180

 

ctctctcaaa agtctcgtcc gaccagaccc gtaaccttaa cctttgtcct gtaactgttt    240

 

cctagccccc tctccccacc ctccccaacc ccccttctgt ttgtgtctgt taacccatcc    300

 

tattcgcacc ttcccggcat tcctttgttt acctgaactc agcttttgag tgtctgtcca    360

 

gtttgaagac gaagtttagt gtcgactgag agttctatat cagtttcatt tgttttgtta    420

 

cttgcttagt gtttcatgtc tactcaaaag cacctgcaag gaatggtaaa cctgacagcg    480

 

caagggatct ctgcccagag agtcctggtg acagccccgg tcatcatcag cctgtttctg    540

 

gtctcgggca cgtcggccag gtacctagat gacgaatgcc ctggtgtcat gggcaacagg    600

 

gacctatacg agaaggtcgt cagggtatgc gacgattgtt ccaacatctt ccgtatgaat    660

 

gatatgggca ccagatgcag gaaggactgt ttctacaacg tggacttctt gtggtgcgtc    720

 

tacgccacgg aacgtcacgg cgacgtggaa cagctcaaca gatggatgag catcctacga    780

 

gccgggagaa aatgaaaaac acgccctcca actgaaatat cctctaaaat aagctccagg    840

 

accacacgcc agaatatact ccatgttttc aagtgatacc gatacattgt gaacatgaca    900

 

tatcagccgg aagaaaaaaa aaaaa                                          925

 

 

<210>  2

<211>  40

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

taatacgact cactataggg gtaaacctga cagcgcaagg                           40

 

 

<210>  3

<211>  40

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

taatacgact cactataggg ccatctgttg agctgttcca                           40

 

 

<210>  4

<211>  285

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

gtaaacctga cagcgcaagg gatctctgcc cagagagtcc tggtgacagc cccggtcatc     60

 

atcagcctgt ttctggtctc gggcacgtcg gccaggtacc tagatgacga atgccctggt    120

 

gtcatgggca acagggacct atacgagaag gtcgtcaggg tatgcgacga ttgttccaac    180

 

atcttccgta tgaatgatat gggcaccaga tgcaggaagg actgtttcta caacgtggac    240

 

ttcttgtggt gcgtctacgc cacggaacgt cacggcgacg tggaa                    285

 

 

<210>  5

<211>  285

<212>  RNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

guaaaccuga cagcgcaagg gaucucugcc cagagagucc uggugacagc cccggucauc     60

 

aucagccugu uucuggucuc gggcacgucg gccagguacc uagaugacga augcccuggu    120

 

gucaugggca acagggaccu auacgagaag gucgucaggg uaugcgacga uuguuccaac    180

 

aucuuccgua ugaaugauau gggcaccaga ugcaggaagg acuguuucua caacguggac    240

 

uucuuguggu gcgucuacgc cacggaacgu cacggcgacg uggaa                    285

 

 

<210>  6

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  6

ccggcattcc tttgtttacc tg                                              22

 

 

<210>  7

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  7

atattctggc gtgtggtcct g                                               21

 

 

<210>  8

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  8

cctgagtgtc tgtccagttt ga                                              22

 

 

<210>  9

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  9

tggtcctgga gcttatttta gagg                                            24