IPP异构酶基因遗传转化对雨生红球藻虾青素含量影响的研究

摘要

虾青素是一种抗氧化活性极强的类胡萝卜素，具有广泛的应用价值。雨生红球藻是自然界虾青素含量最高的生物，能在逆境胁迫条件下大量合成并积累虾青素，其虾青素积累量可高达细胞干重的4％。但生物量提高与虾青素积累的矛盾限制了虾青素的规模化生产，因此通过基因工程手段改造雨生红球藻的生物学特性，提高其生长速度和虾青素含量具有重要意义。
　　 本研究克隆了虾青素合成过程中的关键酶——IPP异构酶基因，利用建立的农杆菌侵染转化体系和基因枪法将ipiHp1基因导入雨生红球藻细胞内，分析过表达IPP异构酶基因的雨生红球藻株生物量及虾青素含量的变化。主要研究成果如下:
　　 1.建立了农杆菌介导的雨生红球藻遗传转化的筛选体系，将外源荧光蛋白egfp基因转入雨生红球藻体内并成功表达。检测了转化子的生物量和虾青素含量，结果表明与野生型雨生红球藻无显著性差异，证明该方法可用于后续的雨生红球藻基因工程改造。
　　 2.利用RT-PCR技术克隆了ipiHp1基因，利用农杆菌介导法将双元载体pCAMBIA3300-egfp-ipiHp1转入雨生红球藻体内，鉴定表明ipiHp1基因已整合到转化子的基因组DNA中，同时检测了转化株虾青素含量的变化，检测发现转化株A3的虾青素含量与野生型有显著差异(P＜0.05)，平均值达到16.49mg/g，比野生型提高了5.16％，为构建高产虾青素的基因工程藻株奠定了基础。
　　 3.构建了基因枪转化载体pBlueScript SKⅡ-bar-egfp-ipiHp1，利用基因枪转化法转入雨生红球藻细胞内，荧光观察及PCR验证发现目的基因已插入到转化子的基因组DNA中，检测了转化子虾青素含量的变化，统计学分析表明转化株虾青素含量与野生型无显著性差异(P＞0.05)。
　　 本研究构建的表达载体和建立的农杆菌转化体系为雨生红球藻的转基因研究奠定了基础，具有重要应用价值。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 虾青素的生理功能及应用

1．1．1 虾青素简介

1．1．2 虾青素的生理功能

1．1．3 虾青素的应用

1．2 虾青素的来源及研究状况

1．2．1 化学合成虾青素

1．2．2 从甲壳类动物加工的废弃物中提取虾青素

1．2．3 利用酵母生产虾青素

1．2．4 利用微藻生产虾青素

1．3 雨生红球藻的生物学特征及虾青素积累机制

1．3．1 雨生红球藻的生物学特征

1．3．2 雨生红球藻的虾青素合成途径

1．3．3 雨生红球藻的虾青素积累机制

1．3．4 影响雨生红球藻积累虾青素的因素

1．3．5 利用雨生红球藻生产虾青素的局限性

1．4 雨生红球藻的遗传转化研究进展

1．4．1 真核微藻遗传转化研究进展

1．4．2 雨生红球藻虾青素合成酶相关基因研究进展

1．4．3 雨生红球藻遗传转化研究进展

1．5 研究内容及其意义

第二章 根癌农杆菌介导的雨生红球藻遗传转化体系的建立

2．1 实验材料

2．1．1 雨生红球藻培养

2．1．2 菌株，克隆载体，工具酶

2．1．3 引物序列与合成

2．1．4 主要试剂

2．1．5 主要仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 雨生红球藻抗生素敏感性检测

2．2．2 根癌农杆菌介导法筛选体系的建立

2．2．3 报告基因egfp与eyfp的克隆及表达模块的构建

2．2．4 双元载体pCAMBIA3300-egfp／eyfp的构建

2．2．5 根癌农杆菌转化

2．2．6 根癌农杆菌介导法的转化程序

2．2．7 阳性转化子的鉴定

2．2．8 阳性转化子的生物量及虾青素含量的检测

2．3 结果与分析

2．3．1 雨生红球藻抗生素敏感性检测及筛选试剂的确定

2．3．2 根癌农杆菌介导法筛选体系的建立与评价

2．3．3 报告基因egfp与eyfp的克隆及表达模块的构建

2．3．4 双元载体pCAMBIA3300-egfp／eyfp的构建

2．3．5 根癌农杆菌介导的雨生红球藻转化结果

2．3．6 阳性转化子的鉴定

2．3．7 阳性转化子生物量及虾青素含量的检测

2．4 本章小结

第三章 根癌农杆菌介导的IPP异构酶的遗传转化

3．1 材料与方法

3．1．1 克隆载体及引物序列

3．1．2 雨生红球藻IPP异构酶基因(ipiHp1)的克隆

3．1．3 IPP异构酶基因表达模块的构建

3．1．4 重组质粒pCAMBIA3300-egfp-ipiHp1的LIC法构建及转化

3．1．5 阳性转化子的鉴定

3．1．6 阳性转化子生物量及虾青素含量的检测

3．2 结果与分析

3．2．1 雨生红球藻IPP异构酶基因(ipiHp1)的克隆及序列测定

3．2．2 重组质粒pCAMBIA3300-egfp-ipiHp1的构建及转化

3．2．3 阳性转化子的鉴定

3．2．4 阳性转化子生物量及虾青素含量的检测

3．3 本章小结

第四章 雨生红球藻IPP异构酶的基因枪转化

4．1 材料与方法

4．1．1 克隆载体及引物序列

4．1．2 选择标记基因bar表达模块的克隆

4．1．3 重组质粒pBlueScript SK Ⅱ-bar-egfp-ipiHp1的构建

4．1．4 基因枪法转化程序

4．1．5 阳性转化子的鉴定

4．1．6 阳性转化子虾青素含量的检测

4．2 结果与分析

4．2．1 选择标记基因bar表达模块的克隆及序列测定

4．2．2 重组质粒pBlueScript SK Ⅱ-bar-egfp-ipiHp1的构建

4．2．3 基因枪法转化雨生红球藻结果

4．2．4 阳性转化子的鉴定

4．2．5 阳性转化子生物量及虾青素含量的检测

4．3 本章小结

第五章 展望

参考文献

致谢