果蝇Fblp生物学功能及转录调控初探

摘要

F-box蛋白是SCF复合体的重要成员，在细胞周期调控、转录调节、细胞凋亡、信号转导等生命活动中发挥着重要的作用。一般情况下，F-box蛋白的N端含有F-box结构域，长度约为50个氨基酸，能够与是Skp1结合，F-box蛋白的C端序列能够与底物特异性的结合。F-box蛋白与Skp1，Cullin和Rbx1构成SCF复合体，作为E3连接酶介导特异性底物与泛素的结合。
　　 在果蝇体内，CG4221基因编码的蛋白含有F-box结构域，它的功能未知，我们暂时命名它为Fblp(F-box like protein)。在本文中，以黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)为实验材料，研究Fblp的生物学功能及转录调控。
　　 首先通过一系列的果蝇杂交实验，得到Fblp的过表达果蝇株，以及CG4221基因部分缺失的果蝇突变株。研究发现，过表达Fblp，能够使果蝇的翅膀变小，眼睛变小，推测Fblp的功能可能与细胞周期的调控相关。突变体果蝇与y w果蝇相比，每对果蝇的产卵量没有显著差异，但是胚胎的结蛹率及羽化成虫的能力明显降低，推测由于CG4221的缺失表达导致果蝇胚胎不能正常发育，造成果蝇死亡及发育迟缓。突变体果蝇CG4221ex95中Fblp蛋白含量略有降低，且突变体果蝇有表型变化。在NCBI网站BLAST Fblp，发现CG9003、ppa与Fblp有较高的同源性，它们也是果蝇体内的F-box蛋白，且与Fblp在果蝇体内的表达谱，在时间上具有一致性，因此猜想它们与Fblp在功能上有重叠，建立CG4221&CG9003和CG4221&CG9952的两个双突变体，观察在缺失CG9003或ppa时，突变体表型变化。同时研究CG4221基因的转录调控，通过5'RACE测序得到CG4221基因的5'端非编码区，转录因子Twist能够通过结合E-box调控基因转录，构建质粒pGL3-2473F、pGL3-2273F，luciferase assay结果显示，Twist能够调控CG4221转录，可能结合位点是在CG4221基因上游-1949 bp，-1888 bp位置的E-box。
　　 Fblp是一种对细胞周期和果蝇个体发育有重要调控作用的蛋白，通过对其生物学功能及分子机制的研究，我们进一步了解Fblp在果蝇发育及细胞周期中的作用。果蝇CG4221基因在人类基因中的有同源基因FBXL7，能够影响细胞增殖，已有报道与癌症相关，在果蝇中研究其同源物Fblp，可能成为癌症治疗中的一个新靶点。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 F-box蛋白

1．1．1 泛素蛋白酶体系统简介

1．1．2 F-box蛋白的发现

1．1．3 F-box蛋白的结构与功能

1．2 Fblp背景介绍

1．2．1 Fblp的结构及在果蝇体内的表达谱

1．2．2 CG4221基因的转录调控

1．2．3 CG9003和ppa简介

1．3 果蝇

1．3．1 概述

1．3．2 果蝇的生物学地位

1．3．3 果蝇基因的遗传学特征

1．4 立题背景

第二章 材料与方法

2．1 实验相关药品和试剂

2．2 实验室主要仪器

2．3 DNA相关实验方法

2．3．1 质粒载体

2．3．2 大肠杆菌感受态细胞DH5α的制备

2．3．3 DNA转化

2．3．4 质粒DNA的提取

2．3．5 质粒DNA的工具酶处理

2．3．6 DNA片段的纯化

2．3．7 DNA连接反应

2．3．8 PCR相关实验

2．3．9 5’RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)

2．4 蛋白质相关实验方法

2．4．1 蛋白质的SDS-PAGE电泳与Western blotting分析

2．5 细胞培养及转染

2．5．1 细胞培养

2．5．2 细胞转染

2．6 果蝇相关实验方法

2．6．1 果蝇饲养

2．6．2 果蝇DNA提取方法

2．6．3 果蝇RNA提取

2．6．4 果蝇蛋白的提取

2．6．5 果蝇品系

第三章 结果与分析

3．1 Fblp在果蝇翅膀中的过表达

3．1．1 过表达Fblp果蝇眼睛变小

3．1．2 过表达Fblp果蝇翅膀变小

3．2 CG4221基因突变体果蝇的生长状况

3．2．1 突变体果蝇胚胎结蛹及羽化成虫能力降低

3．2．2 突变体果蝇羽化成虫能力降低

3．2．3 检测突变体果蝇Fblp水平

3．3 CG4221基因编码的Fblp蛋白的同源物分析

3．3．1 CG9003、ppa与Fblp蛋白可能存在功能重叠

3．3．2 双突变体的获得

3．4 CG4221基因的转录调控

3．4．1 CG4221基因的5’非编码区

3．4．2 CG4221基因的转录调控

第四章 讨论

参考文献

致谢