哺乳动物细胞内Pelo基因缺陷介导的抗病毒作用的研究

摘要

Pelo是一个非常保守的基因，它编码的蛋白在精子发生、细胞周期、减数分裂以及mRNA降解中具有重要的功能。在前期的实验中，我们发现pelo基因缺陷的果蝇对DCV、DXV和IIV6等病毒的感染具有不同程度的抵抗作用。为了验证pelo的抗病毒作用的在不同物种中的保守性，我们在哺乳动物细胞中进行了一系列深入的研究。
　　 我们利用RNA干扰、AAV介导的细胞敲除以及TALEN系统的靶向技术在哺乳动物细胞中对pelo基因进行的表达量的敲低，用VSV和HSV这两种结构和感染机制都差别很大的病毒进行感染，这些病毒的衣壳蛋白的复制在pelo基因表达量下调的细胞中都受到抑制，说明pelo基因的缺陷的确可以使哺乳动物细胞对病毒的感染更加抵抗。而且我们发现，这种pelo表达量降低对于病毒感染的抑制作用，不仅仅停留在对病毒衣壳蛋白表达的抑制，而且对病毒mRNA和基因组的复制情况有相应的影响。
　　 我们在pelo敲低的果蝇s2细胞中，利用蔗糖梯度密度离心，对HIV-1的衣壳蛋白GAG自聚集而形成的各个前体进行分离，发现pelo表达量的降低对GAG的白聚集反应也有一定的影响，但并不如其对病毒蛋白的抑制那样明显。我们猜测，这个对于自聚集反应的影响，可能是pelo表达量对于HIV其他蛋白复制的影响的结果，具体机制还有待于更深入的研究。这些都说明Pelo基因缺陷介导的抗病毒功能在果蝇和哺乳动物中都是保守存在的，其对于病毒的抗性也是广谱的，这可能为抗病毒的研究提供了新思路，使其可能成为治疗病毒感染的新的药物靶点。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 抗病毒天然免疫概况

1．1．1 抗病毒天然免疫简介

1．1．2 天然兔疫中病原分子的模式识别机制

1．1．3 其他免疫成分的抗病毒天然免疫反应

1．2 Pelo蛋白

1．2．1 Pelo蛋白的结构

1．2．2 Pelo蛋白的功能

1．3 常用的基因敲除的方法

1．3．1 腺相关病毒介导的体细胞基因敲除

1．3．2 TALEN介导的体细胞基因敲除

1．4 立体背景

第二章 材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 药品和试剂

2．1．2 实验室主要仪器

2．2 核酸相关实验和方法

2．2．1 质粒载体

2．2．2 质粒构建

2．2．3 感受态细胞的转化

2．2．4 质粒DNA的提取

2．3．5 RNA表达水平的检测

2．3 蛋白质相关实验方法

2．3．1 免疫印迹

2．3．2 蔗糖梯度密度离心

2．4 细胞相关实验

2．4．1 细胞培养

2．4．2 细胞转染

2．4．3 稳定表达细胞株的筛选

2．4．4 慢病毒包装与感染

2．4．5 AAV介导的体细胞基因敲除

2．4．6 TALEN系统进行基因敲除

2．4．7 双链RNA介导的果蝇S2细胞基因敲低

第三章 结果与分析

3．1 利用RNAi在L929细胞中敲低pelo基因

3．1．1 利用RNAi敲低pelo基因的L929细胞对VSV感染有抵抗作用

3．1．2 慢病毒的感染影响细胞对VSV感染的反应

3．2 利用AAV敲低pelo基因的hct116细胞对VSV感染有抵抗作用

3．3 利用TALEN系统敲低pelo基因的L929细胞对病毒感染有抵抗作用

3．3．1 pelo基因敲低的细胞对VSV的感染有抵抗作用

3．3．2 pelo基园敲低的细胞对HSV的感染宥抵抗作用

3．4 pelo影响HIV外壳蛋白GAG的组装

3．5 总结与讨论

附录1 图表索引

附录2 缩略语及中英文对照

参考文献

致谢