产酸克雷伯氏菌HP1氢酶过表达及耐氧机制的研究

摘要

氢是一种清洁的二次能源载体，因其环保、燃烧热值高而备受关注。生物制氢可利用微生物将有机废水、固体有机废物等转化为清洁的氢燃料，从而成为研究热点。生物制氢包括暗发酵产氢、光发酵产氢及光-暗耦合发酵产氢。在微生物体内，生物氢的产生是通过氢酶复合体来介导的，其方向是一定的。在体外，氢酶催化H2(→)2H++2e-的可逆反应，具有应用于H2/O2燃料电池、体外光解水产氢等催化过程的潜力。
　　 产酸克雷伯氏菌HP1(Klesiella oxytoca HP1)是一株具有耐氧产氢特性的高效产氢菌株。本文在对该菌株全基因组测序分析的基础上，构建了氢酶结构大亚基hycE及小亚基hycG过表达的重组工程菌株，分析了重组菌株的氢酶活性、产氢效率及产氢速率。结果表明，在大亚基过表达的重组菌株中，产氢速率和产氢效率分别提高了90.5％、93.5％，氢酶放氢活性也提高了2.1倍。小亚基过表达使产氢速率和效率分别提高了31.7％、33.3％，氢酶活性提高了1.55倍。因此，氢酶的单亚基过表达是提高暗发酵产氢的有效方法。此外，大亚基表达菌株的厌氧产氢效率达到3.43 mol-H2/mol-glucose，远超过大肠杆菌等产氢菌。在有氧条件下，氢酶亚基过表达使得野生产酸克雷伯氏菌的产氢能力提高。
　　 本论文对K.oxytoca HP1氢酶的耐氧性进行了一系列的探究。氨基酸突变分析和蛋白三维结构模型分析显示，氢酶大亚基蛋白上的一些表面氨基酸，尤其是位于气体外部通道入口处的氨基酸，对氢酶的耐氧性有至关重要的作用。这些结果表明K.oxytoca HP1氢酶的耐氧性和氧在酶蛋白内部气体通道的进出情况密切相关，通过pH、氧浓度等环境因子对氢酶耐氧性的分析证实了这一假设。同时，被氧失活的氢酶在氧气被移除后能恢复部分活性，表明K.oxytoca HP1氢酶的耐氧性还取决于氧气通过气体通道进入蛋白活性中心与分子氧在活性中心被还原的速率之间的动态平衡。另外，实验过程中突变菌株G300E(GIy300被Glu代替)显示出较高的耐氧产氢活性，这一结果表明氨基酸突变可能是氢酶应用于体外催化和光解水过程中提高其耐氧性能力。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 生物制氢

1．1．1 光发酵产氢

1．1．2 暗发酵产氢

1．1．3 光-暗耦合发酵产氢

1．2 氢酶

1．2．1 氢酶的分类

1．2．2 氢酶的结构与功能

1．2．3 氢酶的耐氧性

1．3 本文研究目的与内容

第二章 产酸克雷伯氏菌HP1氢酶过表达

2．1．实验材料

2．1．1 菌株与质粒

2．1．2 引物

2．1．3 培养基

2．1．4 常用试剂

2．1．5 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 菌体培养

2．2．2 感受态细胞制备

2．2．3 基因组测序

2．2．4 氢酶结构基因hycE、hycG克隆

2．2．5 表达载体构建及转化

2．2．6 重组菌株厌氧及有氧条件下的发酵产氢

2．2．7 重组菌株氢酶活性检测

2．2．8 大肠杆菌氢酶亚基hycE、hycG同源过表达

2．3 结果与分析

2．3．1 产酸克雷伯氏菌HP1全基因组序列分析

2．3．2 产酸克雷伯氏菌HP1氢酶系统分析

2．3．3 表达质粒载体构建

2．3．4 蛋白表达SDS-PAGE

2．3．5 氢酶活性分析

2．3．6 重组菌株发酵产氢

2．4 讨论

2．4．1 产酸克雷伯氏菌HP1氢酶分析

2．4．2 氢酶亚基在产酸克雷伯氏菌HP1中的过表达

2．4．3 克雷伯氏菌HP1重组菌株发酵产氢分析

第三章 产酸克雷伯氏菌HP1氢酶耐氧机制研究

3．1 实验材料

3．1．1 菌株与质粒

3．1．2 引物

3．2 实验方法

3．2．1 氢酶hycE氨基酸位点突变

3．2．2 同源重组质粒构建

3．2．3 突变菌株发酵产氢及酶活检测

3．2．4 氢酶结构模型构建

3．2．5 氢酶气体分子通道氨基酸点突变

3．2．6 pH、氧浓度等对氢酶耐氧性的影响

3．3 结果与分析

3．3．1 氢酶氨基酸点突变重组菌株构建

3．3．2 突变菌株耐氧发酵产氢活性分析

3．3．3 突变菌株氢酶耐氧活性分析

3．3．4 氢酶结构模型构建及分析

3．3．5 氢酶大亚基结构模型中关键氨基酸分析

3．3．6 表面气体分子通道入口氨基酸对氢酶耐氧活性的影响

3．3．7 微环境因子对氢酶耐氧性的影响

3．4 讨论

3．4．1 酶蛋白表面氨基酸对氢酶耐氧性的影响

3．4．2 氢酶氧耐受性受环境pH值的影响

3．4．3 氧浓度对氢酶耐氧性的影响

结论与展望

参考文献

致谢