产酸克雷伯氏菌HP1可溶性氢酶的分离纯化及特性的研究

摘要

氢酶是微生物氢代谢过程中的关键酶，它催化分子氢的氧化与质子还原(H2←→2H++2e-).对氢酶的研究不仅可以揭示微生物的生理代谢规律，而且对探索和利用微生物制取燃料氢有重要意义.产酸克雷伯氏菌HP1(KlebsiellaoxytocaHP1)是一株放氢活性较高的菌株，其培养条件简单粗放，培养周期短，可以大规模发酵培养，菌体产量高.本研究对K.oxytocaHP1的可溶性氢酶进行分离提纯，并分析了影响可溶性氢酶放氢活性的条件，为进一步研究该氢酶的结构与催化机理奠定了良好的基础. 取菌泥20g悬浮于Tris-HCl缓冲液(30mmol/L，pH8.0)中.菌悬液经超声波处理(400W，破碎35s/次，间歇15s/次，共60次)，高速离心(8,000×g，15min)和超速离心(100,000×g，30min)后得到氢酶的粗提液.粗提液经过20％硫酸铵和60％硫酸铵分部沉淀后，酶被提纯了1.93倍.初步纯化酶液经过SephadexG-25脱盐并超滤浓缩后，过DEAE-SepharoseF.F.柱，采用连续梯度洗脱(0～0.4mol/LNaCl).收集含可溶性氢酶的洗脱液，经过浓缩后，过SephacrylS-200柱.收集含可溶性氢酶活性的组份，再经过浓缩脱盐后，过TSK-DEAE柱，采用分部洗脱，用含有0.3mol/LNaCl的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)沈脱氢酶.经过3次柱层析分离纯化后，氢酶被纯化约200倍，得率为15.3％，氢酶的放氢活性为17.68μmolH2/min·mgprot. K.oxytocaHP1可溶性氢酶催化放氢的最适温度为30℃，当温度超过65℃时，氢酶很快失活.氢酶催化的最适pH值为7.5，在pH5.0～7.5范围内，氢酶的活性随着pH值的升高而增加，在pH7.5～10.0范围内，氢酶的活性随着pH值的增加而降低.氧对氢酶活性有较大的影响，在用纯氧饱和的缓冲液中，氢酶催化活性在3h内失活50％以上.不同电子载体对氢酶的放氢活性有较大影响，甲基紫晶(MV)是氢酶催化放氢的最适人工电子载体.

目录

文摘

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1前言

1.1氢酶的发现及氢酶的分类

1.1.1氢酶的发现

1.1.2氢酶的分类

1.2氢酶的分离纯化

1.2.1菌体破碎方法

1.2.2可溶性氢酶的分离

1.2.3膜结合态氢酶的分离

1.2.4可溶性氢酶与膜结合态氢酶的纯化

1.2.5氢酶的活性检测

1.2.6氧对氢酶分离纯化中的影响

1.3氢酶的结构及催化机理

1.3.1氢酶的结构

1.3.2氢酶的催化机理

1.4氢酶基因的结构及其氢酶的表达调控

1.4.1氢酶的结构基因

1.4.2氢酶基因的表达调控

1.5氢酶的成熟

1.6本论文研究的主要内容

2材料和方法

2.1实验材料

2.1.1菌株

2.1.2培养基

2.1.3主要试剂

2.1.4主要仪器

2.2实验方法

2.2.1菌体的培养

2.2.2产酸克雷伯氏菌HP1粗酶液的制备

2.2.3氢酶的分离纯化

2.2.4氢酶活性的检测

2.2.5蛋白浓度的测定

2.2.6聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及染色

2.2.7氢酶理化性质的测定

3结果与分析

3.1氢酶的分离与纯化

3.1.1可溶性氢酶和膜结合态氢酶的活性染色

3.1.2饱和硫酸铵沉淀

3.1.3 Sephadex-25脱盐及酶液的浓缩

3.1.4 DEAE Sepharose F.F.柱层析

3.1.5 Sephacryl S-200柱层析

3.1.6 TSK-DEAE柱层析

3.2氢酶的理化性质分析

3.2.1温度对氢酶放氢活性的影响分析

3.2.2 pH对氢酶放氢活性的影响分析

3.2.3不同电子载体对氢酶放氢活性的影响分析

3.2.4氧对氢酶放氢活性的影响分析

4讨论

4.1菌体培养方式对氢酶活力和菌体收获量的影响

4.2影响氢酶分离纯化的主要因素

4.3氢酶理化性质分析

4.4结论

5后续工作展望

参考文献

致谢