AIB1蛋白CID结构域特异性DNA适配子的筛选及应用

摘要

原发性肝癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)是我国的常见恶性肿瘤，防治肝癌是全世界防治疾病的重要任务，是医学领域亟待解决的重大课题。
　　 p160蛋白家族的乳腺癌扩增性抗原1(Amplified in Breast Cancer1，AIB1)是一种具有多种生理学功能的转录协同因子，它能够与核受体等多种转录因子相互作用从而增强它们的转录活性。多项研究证明，A1B1在多种肿瘤的恶化过程中起重要的作用。AIB1在68％的肝癌组织中过表达，并且能够促进肝癌细胞的增殖、侵袭和成瘤，是一种公认的癌基因。AIB1由多个功能性结构域组成，其中CBP/p300相互作用结构域（CBP/p300-interaction domain，CBP）参与了AIB1与辅激活因子CBP/p300的结合，而CBP/p300在核受体上的募集是AIB1发挥反式激活作用，行使其促转录作用的必要条件。
　　 SELEX是“配体通过指数富集达到系统进化”(Systematic evolution of ligandsby exponential enrichment)的缩写，用于研究小分子核酸与靶物质相结合的部位、序列及空间构象。经SELEX筛选出的配体为适配子(Aptamer)，能够起到识别靶标蛋白甚至其生物活性抑制的作用。
　　 因此，我们计划用SELEX技术筛选获得特异性和AIB1的CID结构域结合，并抑制AIB1对CPB/p300的募集作用的核酸适配子，从而抑制其促转录激活作用，为肝癌的治疗提供了创新性的思路和方法。
　　 本文以AIB1蛋白的CID结构域为靶标，构建其真核表达载体，获得AIB1-CID-Flag融合蛋白，经过12轮的筛选，获得了8条强结合能力的单链DNA核酸适配子。我们选择其中最优的23号序列作为研究对象，分别检测了它与AIB1五个功能结构域的结合情况和与p160家族三个成员的结合情况。最后，我们用免疫共沉淀验证了筛选所得的CID23核酸适配子能够抑制AIB1对p300蛋白的募集作用。说明我们已经初步筛选得到能够抑制AIB1促转录活性的核酸适配子。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 乳腺癌扩增性抗原1 AIB1

1．1．1 乳腺癌扩增性抗原1 AIB1的发现

1．1．2 乳腺癌扩增性抗原1 AIB1的基因定位与表达情况

1．1．3 乳腺癌扩增性抗原1 AIB1的结构

1．1．4 乳腺癌扩增性抗原1 AIB1的功能

1．1．5 乳腺癌扩增性抗原1 AIB1与肿瘤

1．2 SELEX技术与核酸适配子

1．2．1 SELEX技术的提出和发展

1．2．2 核酸适配子的特点

1．2．3 核酸适配子在生物医学领域中的应用

1．3 立题背景

第二章 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 质粒、菌株、细胞株

2．1．2 抗体

2．1．3 主要试剂及耗材

2．1．4 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 质粒的构建与纯化

2．2．2 人胚肾293T细胞的培养和传代(100mm细胞培养板为例)

2．2．3 细胞的瞬时转染(PEI瞬时转染法)

2．2．4 细胞荧光素酶活性检测

2．2．5 蛋白样品的制备与免疫共沉淀

2．2．6 AIB1 CID(CBP-interaction domain)核酸适配子筛选

2．2．7 克隆与测序

2．2．8 带荧光标记核酸适配子的合成与纯化

2．2．9 激光共聚焦显微镜分析法

2．2．10 核酸适配子选择性的研究

第三章 结果与讨论

3．1 CID结构域的活性是AIB1行使促转录功能所必需的

3．2 AIB1-CID-Flag融合蛋白的表达和纯化

3．3 Flag-AIB1-CID蛋白特异性适配子的筛选结果

3．4 测序克隆及序列分析

3．5 AIB1-CID结构域核酸适配子的选择特异性研究

3．5．1 23号核酸适配子与AIB1五个功能结构域的选择性结合

3．5．2 23号适配子与不同蛋白的结合特异性

3．6 核酸适配子抑制AIB1对p300募集作用

3．7 分析与展望

参考文献

致谢