应用SELEX技术体外筛选PRRSV核衣壳蛋白的DNA适配子

摘要

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起猪繁殖与呼吸综合征，俗称“蓝耳病”。该病1987年最早报道于美国，1991在荷兰分离到病毒，我国大陆哈尔滨兽医研究所于1996年首次报道并分离到病原，目前该病流行于世界各养猪国家，给世界养猪也带来巨大的经济损失。PRRSV不分节段单股正链的RNA病毒，为尼多目动脉炎病毒属，成熟病毒粒子直径约50-60nm，有囊膜。基因组全长约15kb，共有9个开放阅读框（ORFs）。ORF7编码约15kDa的核衣壳(N)蛋白。N蛋白在病毒表达的蛋白中含量高，有4-5个抗原决定簇，免疫原性极强，因此非常适合用于疾病诊断。
　　 指数富集的配体系统进化(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，SLEXE)技术是上世纪九十年代产生的一种新型组合化学技术。应用SELEX技术可以从一个大容量随机寡聚核苷酸文库中筛选针对靶物质的亲和性和特异性的适配子。本实验首次运用SELEX技术筛选特异性针对PRRSVN蛋白的ssDNA适配子。通过测定适配子与N蛋白的亲和性和专一性，评估适配子应用于PRRSV的早期诊断价值。主要研究内容包括:
　　 1.PRRSV核衣壳蛋白的表达纯化
　　 原核表达质粒pET-30a(+)-PRRSV-N转化E.coliBL21(DE3)，在IPTG诱导下大量表达带有6个his标签的PRRSVN蛋白，通过Ni-NTA柱纯化后，PAGE鉴定，得到高纯度的融合表达蛋白。
　　 2.合成初始随机寡聚核苷酸文库及引物
　　 体外化学合成一个中间具有40个随机核苷酸序列的大容量初始随机寡聚核苷酸(ssDNA)文库，随机区两端带有18nt固定序列，该文库含有大量的序列(1015)。引物根据两端固定序列区设计，用于SELEX筛选中次级文库的克隆。
　　 3.SELEX过程
　　 在SELEX过程中，将初始文库转化成dsDNA，作为模板用不对称PCR扩增生成ssDNA文库，ssDNA文库先与空白微孔，PRRSVGP5或阴性血清孵育以减少非特异性序列的富集，再与固定在微孔板上的N蛋白孵育，洗脱特异性结合序列。在下一轮筛选中，洗脱的ssDNA序列作为模板生成dsDNA，然后再生成ssDNA文库，依次进行筛选和洗脱，周而复始。本实验共完成15轮筛选。将最后得到的特异性序列克隆至pGEM(@)-TVector，转化DH5α，我们挑取了34个单克隆菌落。经双酶切鉴定和PCR方法鉴定，测序，获得26个亲和性适配子序列。
　　 4.适配子功能分析
　　 生物素标记的适配子作为“一抗”，辣根过氧化物酶标记的链酶亲和素作为“二抗”，用ELISA的方法检测适配子和PRRSVN蛋白之间的亲和性和特异性，显示得到针对N蛋白的24个亲和性和特异性适配子，一些适配子具有亲和PRRSV特性。碱基组成分析显示26条适配子序列均富含C或T，这可能与亲和PRRSV核衣壳蛋白有关。序列比对分析表明有7个序列出现2次，若干序列之间具有保守的片段。应用DNAMAN软件模拟二级结构，保守序列位于环的顶端或环之间的序列中。
　　 本研究建立以微孔板为介质的SELEX筛选方法，成功筛选到针对PRRSVN蛋白的亲和性适配子，为适配子应用于PRRSV早期检测做出了初步的研究。

目录

声明

摘要

缩略语表(ABBREVIATION)

第一章 文献综述

1．1 PRRSV目前研究进展

1．2 SELEX技术和适配子

1．2．1 SELEX基本原理

1．2．2 初始随机核苷酸文库

1．2．3 靶物质

1．2．4 筛选过程

1．2．5 次级文库生成

1．2．6 克隆和序列分析

1．2．7 特异性和亲和性分析

1．2．8 适配子修饰

1．2．9 SELEX技术和适配子的优缺点

1．2．10 适配子应用及前景

第二章 研究目的和意义

第三章 材料与方法

3．1 实验材料

3．1．1 载体、质粒和细胞

3．1．2 工具酶与主要试剂

3．1．3 主要缓冲液与相关试剂及其配制

3．2 实验方法

3．2．1 PRRSV核衣壳蛋白的表达与纯化

3．2．2 初始随机文库的构建及引物合成

3．2．3 初始文库通过PCR扩增成双链库

3．2．4 琼脂糖凝胶电泳

3．2．5 双链文库的回收

3．2．6 不对称PCR扩增ssDNA文库或生物素标记的ssDNA文库

3．2．7 单链适配子文库的回收

3．2．8 N蛋白的ssDNA适配子筛选过程

3．2．9 ssDNA亚库亲和性测定

3．2．10 筛选产物的克隆及鉴定

3．2．11 测序及序列分析

3．2．12 适配子亲和性和特异性

3．2．13 适配子与PRRSV N蛋白的剂量依赖关系的确定

3．2．14 适配子与PRRSV之间相互作用的鉴定

第四章 结果与分析

4．1 PRRSV核衣壳蛋白的表达纯化

4．2 适配子初始文库的构建及鉴定

4．3 双链文库的生成及回收

4．4 单链文库的生成及回收

4．5 适配子亚库亲和力测定

4．6 筛选产物的克隆

4．7 测序

4．8 序列分析

4．8．1 序列比对及碱基组成分析

4．8．2 二级结构分析

4．9 适配子与N蛋白亲和性分析

4．10 抗原依赖性

4．11 特异性分析

4．12 适配子与PRRSV亲和性鉴定

第五章 讨论与结论

5．1 讨论

5．1．1 PRRSV N蛋白的纯化

5．1．2 初始随机寡聚核苷酸文库构建及引物设计

5．1．3 次级文库的生成

5．1．4 筛选过程

5．1．5 适配子序列分析

5．1．6 适配子亲和性和特异性分析

5．1．7 适配子检测病毒分析

5．2 结论

参考文献

附录

致谢