Slit2-Robo1在肝细胞癌生长过程中的作用及其机制研究

摘要

神经轴突的生长依赖于一系列导向系统的控制。近年来的研究结果表明，神经导向分子系统不仅调控神经系统的发育，在血管新生和肿瘤发展等方面也发挥着重要的调控作用。Slit2及其受体Robo1是神经导向分子Slit-Robo家族中的成员。目前的研究表明Slit2和Robo1可在肿瘤血管新生、侵袭、转移等肿瘤进程中的多个方面产生影响，但在其具体作用上和作用机制尚存在一定的争议。此外，它们在肝癌进程中的作用也未见研究报道。肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，查询资料和我们实验检测都表明在多数肝癌细胞中受体Robo1的表达较正常肝细胞有显著增高，而配体Slit2在肝癌组织的表达虽然有较大的差别，但多数情况下为低调表达。这种受体和配体表达的不一致性提示在肝癌中Slit2和Robo1可能存在复杂的作用机制。为此我们设立本研究探讨Slit2和Robo1在肝癌肿瘤生长过程中的作用及其机制。
　　 我们分别通过建立Robo1及其配体Slit2基因沉默和Robo1过表达的的肝癌细胞系，研究Robo1及Slit2对肝癌细胞的增殖、迁移、粘附和皮下成瘤、转移等特性的影响，以及它们对血管新生的影响。我们的研究发现，在高量表达Robo1的肝癌细胞系(QGY-TR50)中调低该基因表达，癌细胞的增殖力减低、粘附力增强、迁移力降低，皮下裸鼠成瘤的体积减小、重量减低、血管密度显著降低。相反在低量表达Robo1的肝癌细胞系(SK-HEP-1)中过表达该基因，癌细胞系增殖力有升高的趋势，细胞的粘附力降低、迁移力增高，皮下裸鼠成瘤的体积增大，重量增加、血管密度显著增高。通过鼠尾静脉注射实验，我们发现过量表达Robo1的肝癌细胞形成转移瘤的能力明显增强。但是，在针对Robo1的配体Slit2RNAi实验中，我们却发现低调Slit2肝癌细胞的增殖能力升高、粘附力降低、迁移力增强，体积增大，重量增加、血管密度显著增高，鼠尾静脉注射形成转移瘤的能力也明显增强。这与过表达而不是抑制其受体的影响相同。同样，对于癌细胞黏附与转移相关的分子表达的检测也表明过量表达Robo1和低调Slit2表达后都出现E-cadherin降低，N-cadherin及vimentin表达量明显升高;而低调Robo1则结果相反。对实验数据进行Slit2和Robo1表达间关系中我们发现，配体Slit2被干扰后受体Robo1的表达出现升高，而Robo1表达的变化对Slit2的表达则没有发生明显的影响。
　　 以上研究表明，Slit2和Robo1的表达变化均可在多方面影响肝癌的发展，而且受体与配体表达水平对肝癌发展影响存在明显的非同一性;这种非同一性至少部分地与配体Slit2在细胞内对其受体Robo1的抑制性调节有关。Slit2/Robo1信号通路对肿瘤发展的影响应当包括自分泌和旁分泌性的影响，而且也不能排除它们对肝癌的发展可能存在各自独立胞内通路;但影响与癌细胞黏附与转移相关的分子表达至少是Slit2和Robo1效应的共同环节之一。

目录

声明

摘要

前言

1．1 神经导向分子的新功能发现

1．2．神经导向分子配体Slits及其受体Robos的结构

1．3．神经导向分子配体Slits及其受体Robos的功能

1．4．本研究的意义和内容

实验材料与仪器设备

2．1 材料与试剂

2．2 主要仪器

2．3 试剂配方

实验方法

3．1 Robo1基因的克隆

3．2 Robo1表达载体与Robo1及Slit2干扰载体构建

3．3 细胞免疫荧光(immune cytochemistry)

3．4 免疫印迹

3．5 Real-time PCR技术

3．5 Elisa测定法

3．6 裸鼠实验

3．7 细胞粘附、增殖和迁移实验

结果与分析

4．1 受体Robo1及其配体Slit2、Slit3在肝癌细胞中的表达

4．2 Robo1和Slit2干扰载体及Robo1基因表达载体的构建

4．3 Robo1和Slit2基因沉默及Robo1过表达肝癌细胞系的建立

4．4 Robo1及Slit2对细胞迁移、粘附与增殖的影响

4．5 裸鼠皮下成瘤实验

4．6 裸鼠体内肿瘤细胞转移性实验

4．7 Slit2-Robo1对肝癌细胞发生EMT转化的影响

讨论

参考文献

致谢