亚洲带绦虫和链状带绦虫幼虫入侵中间宿主及其致局灶性肝纤维化的研究

摘要

目的:
　　亚洲带绦虫（Taenia asiatica）和链状带绦虫（Taenia solium）都以家猪为适宜中间宿主并可在猪的肝脏寄生，为何前者仅局限于肝脏，而后者还更广泛地寄生于猪全身肌肉及脑等组织器官并可导致人囊尾蚴病？为探讨这个问题，本文拟从以下4个方面进行研究:①了解云南大理地区两种绦虫流行情况并进行虫种分子鉴定和幼虫形态学研究;②研究两种带绦虫六钩蚴和囊尾蚴在猪体的入侵、移行路径、分布和定植的异同;③研究两者致中间宿主肝损伤及局灶性肝纤维化的分子病理机制;④观察两者致灵长类动物囊虫病及肝损害的可能性。
　　方法:
　　1、虫体采集及鉴别
　　在云南大理对带绦虫症患者以口服生南瓜籽、槟榔煎剂驱虫，生理盐水反复清洗，运送至实验室。
　　①形态学鉴别
　　观察成虫头节、孕节形态特征，收集虫卵，经酶法孵育后，取纯化的六钩蚴接种至免疫抑制的小鼠皮下，55～60天后检获囊尾蚴;以形态特征不典型的疑似链状带绦虫虫卵感染猕猴，观察囊尾蚴在猕猴体内的分布;以普通光学显微镜和扫描电镜分别观察囊尾蚴的形态。
　　②分子生物学鉴别
　　提取虫体DNA，并取已知亚洲带绦虫和牛带绦虫作对照，分别以亚洲带绦虫、链状带绦虫和牛带绦虫特异性引物和通用引物进行cox1片段或全基因的PCR扩增，从3种带绦虫PCR阳性的扩增产物中各选择1份进行核酸序列测定，序列登录至GenBank，并用NCBI Blast将各核酸序列与GenBank数据库中带绦虫的cox1进行比对分析。
　　2、两种带绦虫六钩蚴对感染初期实验家猪肠黏膜屏障的破坏及其在宿主体内移行和分布的观察
　　①观察两种六钩蚴对猪肠黏膜屏障功能的影响
　　实验组和对照组乳猪于感染前抽血进行外周血细菌培养和分离血清备用。分别以链状带绦虫和亚洲带绦虫虫卵经消化道感染实验组乳猪，感染第4天，无菌操作抽血分别进行外周血细菌培养和分离血清备用;采用比色法定量检测血清D-乳酸，显色基质鲎试剂法定量检测血清内毒素;取部分小肠组织经固定后分别进行常规石蜡包埋切片HE染色和超薄切片制备，分别以光镜和透射电镜进行组织学观察。
　　②观察两种六钩蚴经消化道感染家猪后在小肠及相邻组织器官的分布，探讨其移行路径
　　于感染第4天取家猪小肠、肠系膜、肠系膜上淋巴结和肝脏进行消化、过滤、离心和分离，分别通过显微镜下仔细寻找和观察六钩蚴的存在，并且采用PCR技术检查两种绦虫DNA的cox1片段在各组织的存在。
　　③耳静脉注射感染亚洲带绦虫六钩蚴后虫体在幼猪体内分布和致病的观察
　　以耳静脉注射的方式使幼猪感染亚洲带绦虫六钩蚴，第35天剖检，取病变组织进行组织病理学检查，观察六钩蚴在幼猪体内各组织器官定植、发育和引起病变的情况，并采用PCR扩增组织中亚洲带绦虫cox1片段。
　　3、带绦虫囊尾蚴致家猪局灶性肝纤维化的病理和分子病理观察
　　分别以亚洲带绦虫和链状带绦虫虫卵经消化道感染家猪，于感染第70天剖检，以放射免疫法进行血清透明质酸的检测、ELISA法进行肝细胞生长因子的检测;取肝组织固定后分别经HE染色和改良Masson染色观察病理特征，以免疫组化法检测肝组织α-平滑肌肌动蛋白和转化生长因子-β1的表达。
　　4、囊尾蚴致局灶性肝纤维化小动物模型的建立
　　以两种带绦虫的六钩蚴经尾静脉注射感染小鼠构建囊尾蚴致肝纤维化小动物模型，感染第55～60天取肝组织以10％中性甲醛固定后分别经HE染色和改良Masson染色观察病理特征，以免疫组化法检测肝组织α-平滑肌肌动蛋白和转化生长因子-β1的表达。
　　5、两种带绦虫虫卵感染猕猴的实验研究
　　以两种带绦虫的虫卵分别经消化道感染猕猴。链状带绦虫感染的猕猴于感染第84天，亚洲带绦虫感染的猕猴于感染第44天抽血分离血清，以全自动生化分析仪进行肝功能检测、固相放射免疫法进行血清透明质酸检测，ELISA法检测囊尾蚴IgG，并对猕猴进行肝脏彩超检查;链状带绦虫感染的猕猴于感染第90天，亚洲带绦虫感染的猕猴于感染第50天剖检，仔细检查肝脏病变，取肝组织以10％中性甲醛固定后进行HE染色，镜下观察病变特征。
　　结果:
　　1、虫种的鉴别
　　①形态学鉴别
　　在云南大理共采集到29条带绦虫，其中25条孕节子宫分支数大于15，初步鉴别为亚洲带绦虫;4条孕节子宫分支数为7～12，其中一条头节受损，形态特征不清楚，另三条有顶突但小钩数目异常，分别为0、4和10，初步鉴定为链状带绦虫。亚洲带绦虫的囊尾蚴有顶突但无小钩，扫描电镜下见囊壁表面有疣状突起，头节顶部有吻状顶突，顶突处无小钩，但却分布大量的菜花样突起，吸盘成发髻样。小钩数目异常的链状带绦虫的幼虫感染猕猴后，幼虫可寄生于猕猴的肌肉和肝脏，肌肉中的囊尾蚴呈现典型的猪囊尾蚴特征，有顶突及内外两圈共28个小钩，电镜下见吸盘呈火山口状，囊壁表面虽无疣状突起，但却有许多沟回和皱折。
　　②分子生物学鉴别:从25条无顶突的带绦虫经特异性引物PCR扩增得到亚洲带绦虫cox1片段，扩增产物的序列与GenBank中多株亚洲带绦虫cox1的同源性为100％，因此鉴定为亚洲带绦虫;头节受损形态不清和3条头节小钩数目异常的带绦虫经特异性引物PCR扩增得到链状带绦虫cox1片段，扩增产物的序列与GenBank中多株链状带绦虫cox1的同源性为99.8％，鉴定为链状带绦虫。
　　2、两种带绦虫六钩蚴对感染初期实验家猪肠黏膜屏障的破坏及其在宿主体内的移行和分布
　　两种带绦虫虫卵经消化道感染第4天的乳猪中分别有一头的外周血细菌培养由感染前的阴性转为阳性，检出大肠埃希菌和变形杆菌;各感染乳猪血清D-乳酸和内毒素含量均较感染前增高（t检验，P小于0.05）;光镜下见肠黏膜明显损伤，损伤级别为Ⅲ～Ⅳ级;电镜观察显示小肠上皮细胞间紧密连接破坏，线粒体肿胀甚至破裂，小肠微绒毛排列紊乱或脱落。两种带绦虫虫卵感染的乳猪小肠、肠系膜和肠系膜上淋巴结可检出六钩蚴或/和其DNA。
　　经耳静脉感染家猪的亚洲带绦虫六钩蚴可在肝脏发育成囊尾蚴，在肺、肾、肌肉、皮下和脑组织均未见囊尾蚴，但肝、肺、肾、肌肉和皮下组织均发现以嗜酸性肉芽肿为主要特征的病变，并且病变组织可扩增出亚洲带绦虫cox1片段。
　　3、带绦虫囊尾蚴致家猪局灶性肝纤维化的病理和分子病理改变
　　感染70天后，两种带绦虫幼虫感染的家猪血清透明质酸和肝细胞生长因子含量均较感染前增高，差异有显著性（P小于0.05）。虫体在宿主肝脏寄生的局部均发生相似的组织病理学改变，主要表现为肉芽肿和局灶性肝纤维化，可见肝细胞水肿和脂肪变性;部分肝细胞呈小灶性坏死;肝血窦扩张、淤血。两种带绦虫幼虫感染的家猪肝组织TGF-β1和α-SMA的表达明显高于对照组，但两组之间无明显差异:TGF-β1在肝窦壁及窦周细胞、坏死灶及汇管区，以及纤维间隔和肝细胞中均有分布;α-SMA广泛表达在纤维间隔、肝窦、纤维间隔周围的肝细胞、汇管区和中央静脉，而正常对照组仅在汇管区血管壁和中央静脉血管壁有表达。
　　4、小鼠肝脏组织病理学改变
　　两种带绦虫幼虫感染在小鼠肝脏引起的组织病理学改变也相似，主要表现为多个肉芽肿，广泛的肝纤维化以及大片的肝细胞坏死，链状带绦虫幼虫感染的小鼠肝脏还可见小胆管增生。感染组小鼠的肝组织TGF-β1和α-SMA的表达和分布情况与感染组家猪相似，表达均较对照组明显增强。
　　5、两种带绦虫幼虫感染猕猴的实验研究
　　链状带绦虫幼虫感染的猕猴体重较感染前减轻2.4kg;肝脏彩超检查显示肝脏内多个结节样回声;血清总胆汁酸盐为感染前的4.5倍，透明质酸为感染前的1.9倍，胆碱酯酶较感染前降低25％;肝组织内见11个结节，结节内可见坏死的虫体和以嗜酸性粒细胞为主的炎症细胞浸润，周围纤维结缔组织增生，可见肝细胞脂肪变性和坏死;血清猪囊尾蚴IgG阳性。亚洲带绦虫幼虫感染的猕猴体重较感染前减轻0.7kg，肝脏彩超检查未见明显异常;血清亚洲带绦虫囊尾蚴IgG阴性;肝组织内未见虫体和病灶。
　　结论:
　　云南大理同时存在亚洲带绦虫和链状带绦虫流行;链状带绦虫头节存在顶突小钩缺失的异常形态表现，可能是当地临床和流行病学调查中链状带绦虫少见的原因之一;利用带绦虫种特异性引物进行cox1片段的PCR扩增或通用引物进行cox1基因的PCR扩增和核酸序列测定可进行人体带绦虫的分子鉴别。两种带绦虫六钩蚴入侵和突破猪肠黏膜屏障的表现相似，并均可经小肠进入血液和淋巴循环，但亚洲带绦虫幼虫仅能适应肝脏的内环境并在肝组织生长和发育，而与其他组织器官不相容。两种带绦虫囊尾蚴在猪肝脏引起相似的病理变化，肝脏的慢性损害刺激TGF-β1的大量表达，激活HSC，活化的HSC又分泌TGF-β1，促进HSC合成细胞外基质，最终导致局灶性肝纤维化。链状带绦虫虫卵能够实验感染灵长类动物猕猴，在肌肉内发育为囊尾蚴的同时引起肝脏的损害，提示在囊虫病流行地区应注意猪囊尾蚴对人体肝脏的损害，可采用肝脏超声检查结合免疫学检测方法进行诊断和筛查。

目录

英文缩略语表

摘要

前言

第一部分 云南大理白族自治州带绦虫的分子鉴定和形态学研究

引言

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第一部分 小结

第二部分 亚洲带绦虫和链状带绦虫幼虫入侵家猪对肠黏膜屏障功能的影响及其在家猪体内移行和分布的比较研究

引言

1．材料

2．方法

3 结果

4 讨论

第二部分 小结

第三部分 两种带绦虫感染致中间宿主肝损伤和局灶性肝纤维化的动物实验研究

引言

1．材料

2．方法

3 结果

4 讨论

第三部分 小结

第四部分 链状带绦虫和亚洲带绦虫幼虫感染猕猴的实验研究

引言

1 材料

2 方法

3．结果

4．讨论

第四部分 小结

全文小结

主要创新点

参考文献

致谢

附：综述

攻读博士学位期间发表的学术论文

攻读博士学位期间申报并获资助科研项目

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