探针熔解曲线技术在食源性致病菌检测分型中的应用

摘要

食品安全问题是世界各国共同关注的焦点，食物中毒事件时有发生且多由食源性致病菌引起。在食源性疾病患者中，大部分为致病性微生物引起的。我国食源性致病菌漏报率高，检测技术落后是其原因之一。因此建立快速简便有效的食源性致病菌检测体系显得尤为重要。本文针对肠致泻性大肠杆菌(DiarrheagenicEscherichia coli，DEC)五种型别的毒力基因进行检测分型，同时针对其它主要病原体进行设计检测，包括金黄色葡萄球菌，沙门氏菌、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核增生李斯特菌、和空肠弯曲杆菌。本论文针对以上7种致病菌的种属基因或肠毒素基因作为靶对象设计实时荧光PCR反应，达到快速检测的目的。在多重PCR检测体系中，运用依赖于杂交连接反应的探针熔解曲线技术提高检测通量，达到1管检测10种以上特异性基因。 第一章，简要介绍食源性致病菌及其临床诊断方法;实时荧光PCR技术;依赖于杂交连接反应的探针熔解曲线技术等原理。第二章，简要阐述DEC的流行病学现状、现有传统检测方法和分子生物学检测方法;运用依赖于杂交连接反应的探针熔解曲线技术针对主要5种型别(Enterotoxigenic E.coli，Enteroaggregative E.coli, Enteroinvasive E.coli, Enteropathogenic E.coli,Enterohemorrhagic E.coli）和2种血清型(O104∶H4，O157∶H7)共13个毒力基因进行实验设计，从而实现一管检测。优化体系并从收集的302份大肠杆菌临床样本中进行PCR检测，检出阳性菌64株(21.2％)，高于感染性腹泻诊断标准的56株(18.5％)，kappa值均大于0.75。第三章，在前面实验的基础上，将依赖于杂交连接反应的探针熔解曲线技术运用到更多的食源性致病菌中。最终建立的体系能够对金黄色葡萄球菌的肠毒素和耐热核酸酶基因(SE-A，SE-B，SE-C，SE-D，SE-E，nuc)、小肠结肠炎耶尔森（ail, foxA）、志贺氏菌（ipaH）、沙门氏菌（ssaR,invA）、单核增生李斯特菌（hly）和空肠弯曲杆菌（gyrA）进行区分。 综上所述，本论文以杂交连接技术、荧光PCR技术和探针熔解曲线分析技术为基础，建立了一种食源性致病菌的通用型检测体系平台。体系特异性高，灵敏度强，能够在一管内对多种食源性致病菌进行同时检测，具备良好的临床应用前景。

目录

声明

摘要

第一章 食源性致病菌与诊断技术

第一节 食源性致病菌及其I临床诊断

第二节 多重实时荧光PCR

第三节 依赖于杂交连接反应的探针熔解曲线技术

第二章 探针熔解曲线技术用于检测致泻性大肠杆菌

第一节 前言

第二节 材料和方法

2．2．1 实验试剂和仪器

2．2．2 核酸的提取

2．2．3 实验引物探针的设计

2．2．4 单管三色检测体系的建立

2．2．5 单管三色检测体系的优化

2．2．6 体系的特异性和灵敏度

2．2．7 体系的最低检出限

2．2．8 体系用于临床分离菌株的应用评估

第三节 实验结果

2．3．1 靶序列标签的筛选和基因位置的选择

2．3．2 杂交连接探针的筛选

2．3．3 实验体系的建立

2．3．4 实验体系的特异性和灵敏度

2．3．5 实验体系的最低检出限

2．3．6 实验体系的应用评估

第四节 讨论

第三章 探针熔解曲线技术用于六种常见食源性致病菌检测

第一节 前言

第二节 材料与方法

3．2．1 实验用菌株

3．2．2 细菌培养方法概述

3．2．3 细菌核酸提取

3．2．4 实验引物探针的设计

3．2．5 实验杂交探针的设计

3．2．6 单管三色体系的建立

3．2．7 实验体系优化

3．2．8 体系重复性特异性实验

3．2．9 体系最低检出限实验

3．2．10 体系的应用

第三节 实验结果

3．3．1 实验体系的建立

3．3．2 实验体系的优化

3．3．3 实验体系的最低检出限

3．3．4 实验体系的应用

第四节 讨论

参考文献

附录1 英文缩写词汇表

附录2 硕士期间发表交流论文

致谢