家蝇幼虫乙醇提取物(MDE)的抗炎活性及分子机理研究

摘要

炎症是感染及许多疾病最基本的病理过程。临床上常用的抗炎药物主要有非甾体抗炎药和甾体抗炎药，其临床疗效显著，但副作用频见报道。因此，寻找低毒高效的新型抗炎药一直是药物研究的一个重要领域。药用昆虫的资源丰富，药用历史悠久，功能主治明确，副作用较小，近年来研究发现许多药用昆虫具有抗炎、抗菌、抗癌、免疫调节等多种药理作用，除斑蝥、虫草等少数几味中药外，大多对其作用机理及活性成分研究不明确。
　　目的：从药学角度，研究以家蝇（Musca domestica）三龄幼虫乙醇提取物为试药，采用多种炎症动物模型和体外炎症模型考察其醇提取物（MDE）抗炎作用，并以与炎症密切相关的细胞因子TNF-α、IL-6、IL-10和炎症介质前列腺素E(PGE)、NO等为切入点对其作用机理进行了深入研究，探讨其对NF-κB p65、COX-2、iNOS合成通路的影响，揭示其抗炎作用的作用靶点。
　　方法：采用乙醇索氏回流提取方法制备家蝇3龄幼虫MDE试药，测定其组分，建立二甲苯所致小鼠耳廓肿胀、大鼠角叉菜胶所致足肿胀、醋酸致痛小鼠扭体、热板致痛动物模型、脂多糖(LPS)所致的小鼠急性肺损伤（ALI）模型，体外细胞炎症等模型，采用病理切片、HE染色观察耳廓组织和ALI小鼠肺组织病理变化，观察RAW264.7细胞炎症反应形态变化等方法研究MDE抗炎保护效应；利用炎症模型动物研究MDE体内抗炎机制，以Griess reagent检测血清中NO含量、MTT检测T、B细胞增殖率、ABC-夹心ELISA检测血清炎症因子 TNF-α、IL-6、IL-10含量、real-time PCR检测 ALI小鼠肺组织中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-10mRNA的表达；western blot检测ALI小鼠肺组织中NF-κBp65的含量，同时，检测MDE对炎症模型动物的部分效应细胞的调节作用；进一步建立LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型，体外研究10％MDE给药血清体外抗炎作用及机制，western blot测定COX-2、iNOS蛋白表达，RT-PCR检测COX-2和iNOS mRNA的表达，炎症因子TNF-α、IL-6、IL-10含量，进而研究其抗炎的分子机理。
　　结果：
　　1. MDE制备、组分分析及抗炎效应研究
　　MDE试药检测结果显示主要含蛋白、多肽或氨基酸、生物碱、糖类或苷类、甾体及萜类等成分。MDE高、中、低（1，0.5，0.25g/kg）剂量下对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀均有明显的抑制作用，抑制率分别为47.61%、38.17%、30.46%，与模型对照组相比有统计学意义；MDE对角叉菜胶所致大鼠足肿胀也有抑制作用，MDE高、中（1，0.5g/kg）剂量下在致炎后2至6小时内均表现出明显的抑制作用，且有量效关系；MDE高、中、低（1，0.5，0.25g/kg）剂量下对小鼠棉球肉芽组织增生有不同程度的抑制作用，与模型对照组相比均有统计学意义，肺组织病理学结果显示，MDE减轻肺水肿，MDE+LPS组镜下见肺间质中度水肿，肺泡壁增宽，有白细胞浸润但较LPS模型组轻，肺泡壁充血但结构完整，炎症程度相对较轻，说明MDE对急、慢性炎症均有抗炎作用。对LPS诱导的RAW264.7体外炎症反应表现为与模型对照组相比，细胞体积缩小，颗粒物质减少，伪足减少，表明具有直接抗炎效应。
　　2. MDE体内抗炎机制研究
　　（1）MDE显著降低大鼠足爪局部炎症组织和血清中PGE2含量，增加角叉菜胶致炎大鼠血清中 SOD含量，降低 MDA含量，降低 NO含量；MDE降低 ALI小鼠肺组织MPO活性及血清中炎症因子（TNF-α、IL-6、IL-10）含量，抑制肺组织炎症因子（TNF-αmRNA、IL-6 mRNA、IL-10mRNA）基因表达水平，显著抑制肺组织NF-κBp65活性和量的增加。
　　（2）碳粒廓清实验结果显示，与模型组比较 MDE给药组均能提高小鼠的吞噬指数α；显著提高SRBC诱导的小鼠体内血清溶血素抗体IgM生成；增强和恢复小鼠DNCB诱导的迟发型超敏反应强度；MDE给药组T、B淋巴细胞增殖率明显增强。
　　3. MDE血清对RAW264.7体外抗炎机理研究
　　对LPS诱导的RAW264.7体外炎症反应的作用及机理研究结果显示，不同浓度的MDE血清剂量依赖的抑制了TNF-α、IL-6的分泌，提高了IL-10的水平；抑制了NO和PGE2的合成，并抑制了一氧化氮合酶（iNOS)和环加氧酶-2（COX-2）基因的mRNA和蛋白表达。
　　结论：MDE的主要成分构成为蛋白、多肽或氨基酸、生物碱、糖类或苷类、甾体及萜类等，具有一定的直接抗炎效应并呈现量效关系，作用机理与调节或干预PGE2的合成，改善机体氧化与抗氧化平衡紊乱状态，调节TNF-α、IL-6、IL-10、NF-κBp65等炎症因子，影响正常和免疫抑制小鼠的体液免疫功能、细胞免疫功能来发挥其抗炎免疫作用。

目录

封面

中文摘要

英文摘要

前言

第一章 MDE抗炎试药制备及抗炎效应研究

一、 MDE制备及对急性、慢性炎症的作用研究

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

5.结论

二、MDE对LPS诱导的小鼠急性肺损伤感染炎症模型的保护作用研究

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

5.结论

三、MDE的镇痛作用

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

5.结论

四、MDE血清对细胞炎症模型的保护作用

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

5.结论

第二章 MDE体内抗炎机制研究

一、 MDE的免疫调节作用

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

5.结论

二、MDE对急性炎症的机理研究

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

5.结论

三、MDE对小鼠ALL炎症的的机理研究

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

5.结论

第三章 MDE血清对RAW 264.7体外抗炎机理研究

一、 MDE血清对LPS诱导的RAW264.7细胞因子分泌的影响

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

5.结论

二、MDE血清对LPS诱导的前列腺素E2和一氧化氮合成的影响

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

5. 结论

全文小结

论文创新点

参考文献

综述一: 中国药用昆虫资源开发应用及研究进展

综述二:炎症反应机制及中药提取物抗炎作用的研究进展

致谢

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