人胚胎干细胞来源的组织工程上皮重建眼表面的基础研究

摘要

本文主要从以下几部分进行论述：
　　第一部分 人胚胎干细胞向表皮外胚层细胞的诱导分化条件的优化
　　目的：从诱导方式、时间、载体以及培养环境中的氧含量等方面优化胚胎干细胞H1向表皮外胚层方向分化条件，实现胚胎干细胞来源的上皮样细胞的体外快速扩增。
　　方法：应用视黄酸(Retinoic acid,RA)和骨形成蛋白4(Bone morphogenetic protein4，BMP4)作为诱导剂，通过不同方式（直接诱导和拟胚体诱导）、诱导时间(2天，4天，6天，8天)、载体（Matrigel和CollagenⅣ）以及调节诱导环境中氧浓度含量（常氧20％ O2和低氧2％ O2）处理H1细胞，使其向表皮外胚层方向分化，观察不同时间点细胞形态变化。为了选取最佳诱导条件，收集各实验组及未诱导H1细胞的RNA，检测胚胎干细胞标志物Oct4，表皮外胚层标志物p63和K18，神经外胚层标志物Nestin，中胚层标志物Brachyury(Bra)，内胚层标志物AFP，Notch和Wnt信号通路相关因子表达的变化情况。为了检测诱导后的上皮样细胞的活性，消化所得上皮样细胞与3T3细胞共培养做上皮细胞克隆培养。为了选取H1来源的上皮样细胞的最佳扩增条件，诱导后得到的上皮样细胞同一密度接种于CollagenⅣ处理的培养皿中，利用添加或不添加Y27632的扩增培养基KSFM，KSFM+Supplement，KSFM+SHEM(2∶1)，KSFM+SHEM(3∶1)进行培养，并用倒置相差显微镜观察各扩增条件下细胞形态，比较各组细胞增殖能力及上皮表型的维持情况。
　　结果：联合应用RA和BMP4诱导H1细胞，随着诱导时间的增加，胚胎干细胞标志物Oct4逐渐下降，表皮外胚层标志物K18和p63表达逐渐增加，中胚层标志物Bra及内胚层标志物AFP表达水平较低，诱导8天为最佳时间点。贴壁诱导方式与拟胚体诱导方式相比可得到p63表达更高的上皮样细胞。诱导后的细胞可形成克隆且表达PanCK和p63。利用Matrigel作为诱导载体更易于表皮外胚层的分化。常氧条件下可抑制诱导过程中AFP和Bra的表达，且促进p63的表达。KSKFM+SHEM(2∶1)中培养的上皮样细胞增殖能力强，细胞连接清晰可见。低氧培养条件和Y27632可提高H1来源的上皮样细胞存活量及增殖能力。Notch1和Jagged1在H1向上皮方向分化过程中表达量降低，但在上皮样细胞扩增过程中，加入Y27632后，伴随着细胞增殖能力的增加，Notch1和Jagged1的表达量增加，而c-myc和Cyclin D1表达量在诱导和扩增过程中都降低。
　　结论：(1)H1细胞接种于Matrigel胶上，利用贴壁诱导方式，常氧(20％)培养环境下联合应用视黄酸和骨形成蛋白BMP4诱导H1细胞8天，更易于促进H1细胞向表皮外胚层方向诱导，同时抑制其向内胚层和中胚层方向分化，得到具有干细胞特性的上皮样细胞。(2)KSFM+SHEM(2∶1)和KSFM+Supplement均可作为备选扩增培养基。(3)扩增过程中，低氧培养环境和Y27632的加入可增加H1来源的上皮样细胞的存活率和增殖能力。(4)在H1诱导向上皮方向诱导分化过程中，Wnt和Notch信号通路被抑制，而在扩增过程中，Y27632的加入可激活Notch信号通路，同时抑制Wnt信号通路从而促进上皮样细胞增殖。
　　第二部分 胚胎干细胞系H1来源的上皮样细胞片的构建
　　目的：构建胚胎干细胞H1来源的上皮样细胞片。
　　方法：制备冻干去上皮羊膜，将H1来源的上皮样细胞接种于羊膜上，前4天浸没培养，然后进行气液界面培养14天。按培养环境的氧浓度不同，可分为三个组即低氧(2％)组，常氧(20％)组，低氧-常氧相结合组（前4天2％氧浓度，后14天20％氧浓度下培养，每组分别利用添加10μMY27632的KSFM+Supplement和KSFM+SHEM(2∶1)两种扩增培养基进行培养。终止培养后，一部分用虹膜恢复器刮取上皮片，刮下的细胞片收集蛋白;一部分连同羊膜固定包埋，用HE、免疫荧光、免疫组织化学和Western blot方法对其表型进行检测。
　　结果：低氧、常氧和低氧-常氧相结合组的细胞均可在冻干去上皮羊膜上存活，培养18天后，低氧和常氧组中细胞只可形成零碎的小片细胞片，且易破碎。低氧-常氧相结合组可轻易刮下完整透明上皮片，且不易破碎。包埋做HE染色可见低氧组中细胞仅为单层，完全常氧和低氧-常氧相结合组中的上皮片全部为3-4层细胞，其中低氧-常氧相结合组的细胞排列较为紧密。免疫荧光、免疫组织化学、Western blot结果显示，各组中细胞均表达PanCK、K18和p63，低氧-常氧相结合组部分细胞表达K14，但未见有Vimentin和Pax6表达。两种培养基表达上述标志物情况类似，但K10仅表达在KSFM+Supplement+Y27632培养基培养的细胞中。
　　结论：采用低氧-常氧相结合的方式接种于羊膜上可得到完整，透明的上皮片，并可轻易从羊膜上刮下，通过表型检测发现此构建的上皮片含有部分干细胞。
　　第三部分 胚胎干细胞系H1来源的上皮样细胞片体内功能检测
　　目的：采用动物模型对胚胎干细胞来源的上皮片进行眼表面重建的体内功能检测。
　　方法：将KSFM+Supplement+Y2732和KSFM+SHEM(2∶1)+Y27632培养的H1来源的上皮样细胞片做细胞追踪标记后，移植入健康裸鼠皮下，上皮面紧贴皮肤上皮基底层，2周后观察其移植部位是否成瘤。将健康新西兰大白兔角膜缘及角膜上皮予以完全性机械刮除，制造角膜上皮干细胞缺乏模型。随机分组。移植去上皮羊膜作为对照组A。分别移植KSFM+SHEM(2∶1)+Y27632(实验组B)和KSFM+Supplement+Y2732（实验组C）培养的H1来源的上皮样细胞片连带羊膜到眼表面，用生物胶粘合。术后常规用药，术后每天于裂隙灯显微镜下做眼表常规检查，2周后处死实验兔，用免疫荧光及免疫组化技术进行PanCK，K14，K3/K12及Pax6表达的检测。
　　结果：将构建的H1来源的上皮样细胞片移植入健康裸鼠体内2周后未见肿瘤形成。在角膜缘干细胞缺乏兔模型上移植其上培养或未培养细胞的冻干去上皮羊膜，2周后观察发现对照组A组兔角膜基质水肿、浑浊，周边角膜新生血管长入，中央角膜上皮生长不良，HE染色有炎症细胞浸润。实验组B组兔和C组兔角膜上皮均已愈合。未见明显新生血管长入，HE染色未见明显炎症细胞。免疫荧光染色显示PanCK，K3/K12在各组兔角膜表达情况与在未手术正常兔角膜上皮类似。K14仅表达于正常兔角膜上皮基底细胞层，但在术后三组兔中的周边角膜及中央角膜均出现表达。在B组兔中可见移植的H1来源的上皮样细胞，并出现PanCK，K3/K12，K14和Pax6表达。
　　结论：构建的H1来源的上皮样细胞未检测到成瘤效应，且在体内有被诱导成角膜上皮细胞的潜力，对角膜干细胞缺乏的兔模型的眼表重建有一定治疗作用。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 角膜缘上皮干细胞的重要性

1．1．1 角膜缘上皮干细胞缺乏

1．1．2 角膜缘上皮干细胞缺乏治疗现状

1．2 胚胎干细胞

1．3 胚胎干细胞向表皮外胚层方向分化

1．3．1 胚胎干细胞向角膜上皮方向分化不同阶段

1．3．2 胚胎干细胞向衰皮外胚层分化诱导条件

1．4 胚胎干细胞向表皮外胚层分化诱导中主要存在的问置

1．4．1 诱导时间长，诱导效率低

1．4．2 角膜上皮结构表型及功能性欠缺

1．4．3 安全性

第二章 人胚胎干细胞向表皮外胚层细胞分化诱导条件的优化

2．1 实验材料

2．1．1 细胞与组织

2．1．2 主要化学试剂

2．1．3 主要耗材

2．1．4 抗体

2．1．5 主要仪器设备

2．1．6 主要溶液配制

2．2 实验方法

2．2．1 人胚胎干细胞系H1的正常培养

2．2．2 H1细胞向上皮细胞诱导分化

2．2．3 H1来源的上皮细胞克隆培养方法

2．2．4 H1来源的上皮样细胞的扩增

2．2．5 3T3细胞的培养

2．2．6 人角膜上皮克隆的培养

2．2．7 免疫荧光染色

2．2．8 免疫组织化学染色

2．2．9 RNA提取、逆转录与实时定量PCR

2．3 实验结果

2．3．1 不同诱导时间对H1细胞向上皮细胞诱导分化的影响

2．3．2 不同诱导方式对H1细胞向上皮细胞诱导分化的影响

2．3．3 不同诱导载体对H1细胞向上皮细胞诱导分化的影响

2．3．4 氧浓度对H1细胞诱导分化成上皮细胞的影响

2．3．5 H1来源的上皮细胞在体外扩增培养基的选取

2．3．6 H1来源的上皮细脑在体外扩增培养基的优化

2．3．7 Notch和Wnt信号通路在H1向上皮细胞方向游导中的变化情况

2．4 小结

第三章 胚胎干细胞系H1来源的上皮样细胞片的构建

3．1 实验材料

3．1．1 细胞与组织

3．1．2 主要化学试剂

3．1．3 主要耗材

3．1．4 抗体

3．1．5 主要仪器设备

3．1．6 主要溶液配制

3．2 实验方法

3．2．1 TKE2细胞的培养(用于阳性对照)

3．2．2 去上皮羊膜环的制备

3．2．3 H1来源的上皮片构建

3．2．4 标本的包埋与切片

3．2．5 苏木精—伊红染色法

3．2．6 Western blot

3．3 实验结果

3．3．1 H1来源的上皮样细胞片的构建

3．3．2 H1来源的上皮细胞片的形态学观察

3．3．3 H1来源的上皮细胞片的表型检测

3．4 小结

第四章 人胚胎干细胞来源的上皮样细胞片的眼表面重建

4．1 实验材料

4．1．1 实验动物

4．1．2 细胞与组织

4．1．3 主要化学试剂

4．1．4 主要耗材

4．1．5 抗体

4．1．6 主要仪器设备

4．1．7 主要溶液配制

4．2 实验方法

4．2．1 细胞标记追踪(按细胞试剂盒说明书操作)

4．2．2 H1来源的上皮片成瘤性检测

4．2．3 眼表面重建手术

4．2．4 组织病理学观察

4．2．5 HE染色检查

4．2．6 免疫荧光及免疫化学染色

4．3 实验结果

4．3．1 H1来源的上皮样细胞片成瘤性检测

4．3．2 胚胎干细胞来源的上皮样细胞羊膜片覆盖术

4．3．3 HE染色结果

4．3．4 免疫组织化学染色结果

第五章 讨论

5．1 人胚胎干细胞系H1的选取

5．2 诱导条件的选择

5．3 上皮样细胞扩增条件的选择

5．4 扩增培养基的优化：Y27632可促进H1来源的上皮样细胞的扩增和存活率

5．5 信号通路对胚胎千细胞对表皮外胚层细胞分化过程中的影响

5．5．1 Notch信号通路

5．5．2 Wnt信号通路

5．6 扩增载体的选择：冻干去上皮羊膜

5．7 氧浓度的调节在H1来源的上皮片构建中的应用

5．8 影响上皮复层化因素

5．9 H1来源的上皮片结构分析

5．10 H1来源的上皮片未见pax6蛋白表达可能原因

5．11 胚胎干细胞来源的上皮样细胞片的组织相容性

5．12 体内微环境对H1来源的上皮片向角膜上皮分化的影响

全文总结

附录

参考文献

致谢

博士在读期问相关成果