眼表细胞来源的诱导性多能干细胞向角膜上皮样细胞定向分化的研究

摘要

目的：诱导患者来源的眼表细胞产生iPS细胞，并诱导这种病人特异的iPS细胞向角膜上皮干细胞定向分化。
　　 方法:采用患者来源的翼状胬肉基质成纤维细胞(PSF)和人结膜上皮细胞(HCjE)，通过逆转录病毒载体介导将OCT4、SOX2、c-MYC和KLF4等4种转录因子导入细胞中，经过一系列的条件诱导过程，诱导这两种细胞转化成iPS细胞。然后采用碱性磷酸酶染色、RT-PCR检测、免疫荧光染色、基因芯片分析等方法对所诱导的iPS细胞进行鉴定。最后采用IV型胶原加KSFM培养基单独培养、IV型胶原加SHEM培养基单独培养、IV型胶原加KSFM和SHEM培养基轮流诱导的方法诱导iPS细胞向角膜上皮干细胞方向分化，分化细胞表型采用免疫荧光染色检测K3、K12、p63和ABCG2等标记物进行鉴定。
　　 结果:我们成功将患者来源的眼表细胞（翼状胬肉基质成纤维细胞和人结膜上皮细胞）诱导成iPS细胞。经鉴定，诱导产生的iPS细胞与胚胎干细胞极其相似，多能性良好，碱性磷酸酶染色结果呈阳性，细胞内源性表达DPPA4、TERT、NANOG、GDF3、REX1、ESG1、OCT3/4、SOX2、KLF4、c-MYC等胚胎干细胞标记基因，同时细胞也表达SSEA4、TRA-1-81、NANOG、OCT4、LIN28等胚胎干细胞标志物，诱导产生的PSF-iPSCs与ESCs在全基因表达谱上有高度的相似性，两者在系统树图中归属同一聚类。RT-PCR检测结果显示人结膜上皮细胞内源性表达OCT4、SOX2等多种胚胎干细胞标记基因，用其诱导iPS细胞的效率比普通成纤维细胞高出10倍左右。采用IV型胶原加KSFM和SHEM培养基轮流诱导的方法成功将这种病人特异的iPS细胞诱导成角膜上皮样细胞。
　　 结论:患者来源的翼状胬肉基质成纤维细胞和人结膜上皮细胞都可以被诱导成iPS细胞。采用IV型胶原加KSFM和SHEM培养基轮流诱导的方法，能够诱导iPS细胞向角膜上皮样细胞定向分化。我们的研究结果为自体角膜上皮干细胞移植提供一种可能的种子细胞来源。