人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞超微结构观察方法的优化

摘要

背景视网膜色素上皮（RPE）细胞的正常超微结构是其执行正常生理功能的解剖基础，目前用透射电子显微镜（TEM）检测RPE细胞的超微结构时常用细胞沉淀法，但经过胰蛋白酶消化的细胞会破坏原有的细胞生长状态，无法真实地反映出体外培养的RPE细胞的超微结构。目的探索一种能够简单、真实地反映体外培养的人胚胎干细胞（hESC）来源的RPE细胞超微结构的方法。方法将hESC经自然分化法诱导为hESC来源的RPE（hESC—RPE）细胞，采用免疫荧光法检测hESC—RPE细胞特异性蛋白小眼畸形相关转录因子（MITF）和人类配对盒基因6（PAX6）的表达。将hESC—RPE细胞种植于Transwell小室上进行培养，待细胞形成细胞片后通过TEM进行超微结构的观察，并与细胞沉淀法制备的hESC—RPE细胞标本的超微结构和90日龄LongEvans大鼠体内RPE细胞的超微结构进行比较。结果hESC—RPE细胞MITF和PAX6表达阳性。TEM下可见大鼠体内RPE细胞正常的超微结构，包括顶端微绒毛、极性分布的RPE细胞色素颗粒和细胞核、细胞基底膜和细胞间紧密连接。细胞片法TEM下可见Transwell小室上细胞片中hESC—RPE细胞形成了类似于大鼠体内RPE细胞的超微结构，但细胞顶端微绒毛较短，而细胞沉淀法观察到hESC—RPE细胞的细胞质中散在分布的色素颗粒、非极性的细胞核和少量的微绒毛。结论TEM观察细胞超微结构时细胞片法不经过细胞的消化过程，保留了hESC—RPE细胞的正常结构，能简单、真实地反映体外培养RPE细胞的超微结构。