重组噬菌体在致病菌检测中的应用

摘要

致病菌的快速、灵敏、特异性检测对食品质量监管、公共安全、环境卫生监测、细菌致病机理研究、疾病的诊断与治疗等具有重要意义。依靠各种生化反应的传统致病菌检测方法不仅操作复杂、检测周期长，且无法用于检测难培养的致病菌;而以抗原-抗体识别为基础的检测方法需要使用价格昂贵并难以获取的特异性抗体，限制了该方法的适用性。噬菌体是一类以细菌为宿主的病毒，广泛存在于自然界中，种类繁多，能够快速繁殖，对宿主菌具有良好的专一识别性。噬菌体基因组简单且易于改造，目前，利用分子生物学技术构建的重组噬菌体探针已成为致病菌检测的重要研究工具，被广泛应用于多种致病菌的特异性检测。
　　肠出血性大肠杆菌E.coliO157∶H7是一种对人类具有极大危害的致病菌。论文第二章主要介绍了构建以E.coliO157∶H7为宿主的重组噬菌体PPO1-TCSOC，结合四半胱氨酸标签—双砷染料体系建立E.coliO157∶H7的特异性检测方法。四半胱氨酸标签—双砷染料体系是一种具有广阔应用前景的活细胞蛋白荧光标记方法。该方法使用一种能够跨膜的荧光探针（如F1AsH-EDT2），能够与连接在蛋白上的四半胱氨酸标签（简称TC-tag，氨基酸序列为CCXXCC，其中X代表半胱氨酸C以外的任意氨基酸）发生特异性结合，形成发出强荧光的TC—双砷染料复合物。TC-tag体积小，不会干扰被标记蛋白的生物活性以及细胞的生命活动;此外，该体系荧光量子产率高，分子间相互作用稳定性强，标记速度快，是一种适用性更加广泛的蛋白质荧光标记方法。我们通过对噬菌体PPO1进行基因改造得到PPO1-TCSOC，使其SOC蛋白上携带TC-tag。重组噬菌体侵染E.coliO157∶H7后短时间内在细菌内部大量扩增，其SOC蛋白上的TC-Tag与侵染时共同加入的双砷染料FlAsH特异性结合，产生较强的荧光信号，使E.coli O157∶H7能够在荧光显微镜以及本实验室搭建的超高灵敏流式检测仪(HSFCM)上被特异地检出，发展了一种快速、灵敏、特异性强的致病菌检测方法。
　　噬菌体展示(Phage Display)是一种将外源多肽DNA序列与噬菌体基因组中特定蛋白的基因进行连接，并将外源多肽表达于噬菌体表面的技术。本论文第三章主要介绍了利用噬菌体展示技术构建双功能重组噬菌体，并将其应用于致病菌口的检测。我们以商品化的噬菌体M13KE为模型，通过在其pⅧ衣壳蛋白上插入能够特异结合亲和素的AvS多肽序列作为荧光标记位点，在pⅢ蛋白上插入E.coliO157∶H7的表面脂多糖(LPS)识别多肽序列O157S作为E.coli O157∶H7的捕获位点，构建了pⅧ与pⅢ蛋白上分别展示两种多肽的双功能重组噬菌体探针O157S-M13KE-AvS。这种噬菌体能够通过pⅢ蛋白上携带的细菌表面LPS识别多肽大量吸附在E.coli O157∶H7的表面，而其pⅧ衣壳蛋白上展示的AvS多肽在加入荧光标记的亲和素后将会与其发生特异性结合，使噬菌体以及与噬菌体所结合的靶标菌E.coli O157∶H7发出荧光，通过荧光显微镜以及超高灵敏流式检测仪可检测到单个菌体的荧光信号。通过噬菌体展示技术能够快速得到专一识别靶标致病菌的重组噬菌体，解决了致病菌的特异性抗体难以获取的难题，为致病菌的检测提供了简便、准确、灵敏的新方法。
　　论文第四章主要介绍了利用多种双功能重组噬菌体组成噬菌体“鸡尾酒”，并将其应用于致病菌的检测，希望建立一种步骤简单、检测成本低并适用于多种致病菌快速检测的方法。以第三章的工作为基础，我们分别构建了对鼠伤寒沙门氏杆菌以及铜绿假单孢杆菌具有特异识别效应的双功能重组噬菌体探针。通过将几种噬菌体制成“鸡尾酒”，实现了E.coliO157∶H7、鼠伤寒沙门氏杆菌与铜绿假单孢杆菌3种致病菌的同时定量检测，初步建立一套简便、灵敏、普适性强的致病菌检测体系，简化了致病菌的检测流程并缩短了实验周期。
　　本论文的主要成果如下:1、建立了TC-PPO1-FlAsH体系，实现了致病菌E.coliO157∶H7的特异性检测。该检测体系不仅检测周期短、操作简单，而且克服了单克隆抗体难以获取、价格昂贵的缺点，为致病菌的专一性检测提供了一种快速、灵敏、适用性广泛的新方法;2、以商品化的M13KE噬菌体展示体系为模型，建立双功能噬菌体展示平台，构建了重组噬菌体O157S-M13KE-AvS、PaS-M13KE-AvS与SaS-M13KE-AvS，并将其应用于E.coliO157∶H7、铜绿假单孢杆菌与鼠伤寒沙门氏杆菌等致病菌的检测，为设计与合成用于病原微生物检测的探针提供了新的思路;3、运用噬菌体“鸡尾酒”策略，实现了复杂样品中多种致病菌的同时准确检测，建立了具有广泛适用性的病原微生物检测体系，扩展了重组噬菌体探针在致病菌检测方面的应用前景。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 引言

1．2 致病菌的检测方法

1．3 基于噬菌体探针的致病菌检测技术

1．3．1 噬菌体

1．3．2 噬菌体探针在致病菌检测中的应用

1．3．3 基于重组噬菌体的致病菌检测技术

1．4 双砷染料—四半胱氨酸标签蛋白标记体系

1．5 超高灵敏流式检测技术在生化分析中的应用

1．5．1 超高灵敏流式检测仪简介

1．5．2 超高灵敏流式检测仪在生化分析中的应用

1．6 本论文的选题思路与研究内容

参考文献

第二章 TC-PPO1-FlAsH检测体系的建立

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 实验仪器和试剂

2．2．2 实验步骤

2．3 实验结果与讨论

2．3．1 重组噬菌体PPO1-TCSOC的构建

2．3．2 重组噬菌体PPO1-TCSOC生物活性的研究

2．3．3 TC-PPO1-FlAsH检测体系条件的优化

2．3．4 TC-PPO1-FlAsH检测体系检测E．coil O157：H7

2．3．5 荧光显微镜检测E．coli O157：H7

2．3．6 TC-PPO1-FlAsH检测体系特异性的考察

2．3．7 TC-PPO1-FlAsH体系检测混合菌中的E．coli O157：H7

2．4 本章小结

参考文献

第三章 双功能噬菌体检测致病菌体系的建立

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 实验仪器和试剂

3．2．2 实验步骤

3．3 实验结果与讨论

3．3．1 重组噬菌体O157S-M13KE-AvS的构建

3．3．2 O157S-M13KE-AvS重组噬菌体用于检测致病菌可行性的考察

3．3．3 O157S-M13KE-AvS检测E．coli O157：H7体系实验条件的优化

3．3．4 双功能噬菌体O157S-M13KE-AvS检测E．coli O157：H7

3．3．5 荧光显微镜检测E．coli O157：H7

3．3．6 双功能噬菌体O157S-M13KE-AvS检测方法特异性的考察

3．3．7 O157S-M13KE-AvS检测混合菌中的E．coli O157：H7

3．4 本章小结

参考文献

第四章 双功能噬菌体“鸡尾酒”检测多种致病菌

4．1 引言

4．2 实验部分

4．2．1 实验仪器和试剂

4．2．2 实验步骤

4．3 实验结果与讨论

4．3．1 重组噬菌体SaS-M13KE-AvS与PaS-M13KE-AvS的构建

4．3．2 双功能重组噬菌体用于目标致病菌的检测

4．3．3 不同靶标菌与重组噬菌体之间交叉反应的考察

4．3．4 噬菌体“鸡尾酒”检测混合菌中的靶标菌

4．4 本章小结

参考文献

第五章 总结与展望

在校期间发表论文

致谢