TIPE2通过上调caspase下调NF-κB促进佐剂型关节炎大鼠滑膜成纤维样细胞凋亡

摘要

目的:TIPE2能够抑制炎症以及肿瘤的发生发展，并且TIPE2过表达能够促进细胞的凋亡。类风湿关节炎是一种免疫多态性慢性疾病，我们应用类风湿关节炎模型大鼠佐剂型关节炎滑膜成纤维样细胞(fibroblast-like synoviocytes of ratadjuvant arthritis，AA-FLS)，通过体外实验分析TIPE2对死亡受体5诱导细胞凋亡的作用探讨TIPE2对佐剂型关节炎发病的影响。
　　方法:通过RT-PCR、荧光实时定量PCR和Western-blotting技术检测正常大鼠滑膜成纤维样细胞以及AA-FLS中TIPE2的表达，明确TIPE2在两种细胞系的表达情况。进一步应用慢病毒载体稳定转染AA-FLS，提高TIPE2在AA-FLS的表达并应用荧光显微镜、RT-PCR、荧光实时定量PCR和Western-blotting技术进行鉴定。通过细胞增殖实验以及流式细胞术应用抗DR5单链抗体ZF1研究TIPE2对AA-FLS细胞增殖及凋亡的影响，Western-blotting，caspase8活性检测试剂盒检测相关蛋白的表达，并用caspase抑制剂Z-VAD-FMK以及NF-κB抑制剂Bay同步干扰试验组，然后通过流式细胞术检测凋亡，研究TIPE2调控的可能机制。
　　结果:通过RT-PCR、荧光实时定量PCR和Western-blotting技术检测发现TIPE2在正常大鼠滑膜成纤维样细胞表达，在AA-FLS中表达明显降低。通过慢病毒载体转染技术，获得TIPE2过表达稳定细胞株TIPE2+/+-FLS以及相应的空载组细胞株MIGR1-FLS。在TIPE2+/+-FLS稳定细胞株中，TIPE2基因水平及蛋白水平的表达都显著上调，TIPE家族其他成员如TIPE1，TIPE3的表达量没有改变。ZF1刺激后，细胞生长抑制率、细胞凋亡率及DR5的表达量以及caspase8的活化量在TIPE2+/+-FLS均有明显的增加，与MIGR1-FLS组相比，差异显著，具有统计学意义;并且TIPE2+/+-FLS磷酸化的NF-κB和磷酸化的AKT明显下调，与MIGR1-FLS组相比，差异显著。在ZF1处理前60min，TIPE2+/+-FLS组给予caspase抑制剂Z-VAD-FMK预处理，MIGR1-FLS组给予NF-κB抑制剂Bay预处理，结果提示caspase抑制剂Z-VAD-FMK预处理的TIPE2+/+-FLS组凋亡率明显降低，其凋亡率与MIGR1-FLS组相当;NF-κB抑制剂Bay预处理的MIGR1-FLS组凋亡率明显提高。
　　结论:提高TIPE2的表达可以提高ZF1诱导AA-FLS凋亡的敏感性，其机制可能有两点，其一:TIPE2上调AA-FLS膜跨膜蛋白DR5表达上调，激活更多的caspase;其二:抑制NF-κB和AKT的活化。

目录

声明

摘要

第一章 前言

一、类风湿关节炎的发病因素

1 细胞因子与RA

2 Th1／Th2平衡与类风湿性关节炎

3 细胞凋亡与类风湿性关节炎

4 性激素与类风湿性关节炎

5 原癌基因与类风湿性关节炎

二、类风湿关节炎的治疗

1 内科治疗

2 外科手术治疗

3 生物治疗

4 基因治疗

5 造血干细胞移植治疗

三、佐剂型关节炎大鼠模型的应用

四、作为免疫相关性疾病靶点的死亡受体5(Death receptor 5，DR5)的研究进展

1．死亡受体5(DR5)的结构及分布

2．死亡受体5(DR5)诱导肿瘤细胞凋亡

3．TRAIL与类风湿性关节炎

五、TIPE2的研究进展

1．TIPE2基因定位结构及其表达

2．TIPE2基因表达与分布

3．TIPE2生物学功能

4．TIPE2与免疫相关疾病

六、实验方案设计

1．研究目的和意义

2．研究内容

第二章 TIPE2过表达质粒转染佐剂型关节炎大鼠滑膜成纤维样细胞以及鉴定

一、材料和方法

1．材料

2．方法

二、结果与分析

1．TIPE2在AA-FLS中低表达

2．TIPE2过表达质粒和MIGR1空载质粒转染AA-FLS

3．RT-PCR及Q-PCR检测TIPE2+／+-FLS、MIGR1-FLS中TIPE2的表达特点

4．Western检测TIPE2+／+-FLS、MIGR1-FLS中TIPE2表达

三、讨论

第三章 TIPE2在佐剂型关节炎大鼠滑膜成纤维样细胞的凋亡中的作用及其机理初步研究

一、材料和方法

1．材料

2．方法

二、结果与分析

1．MTT法检测抗DR5单链抗体ZF1在不同时间点对TIPE2+／+-FLS的细胞毒性效应

2 Cystain DNA 1step染色流式细胞术对ZF1诱导细胞凋亡率的检测

3 Annexin V／PI流式细胞术检测转染后AA-FLS细胞凋亡

4 Western blot检测细胞caspase8、caspase3、caspase9、Bid和Bax蛋白表达

5 caspase8活性检测

6 Western blot检测细胞活化的caspase8蛋白表达

7 Western blot检测细胞TIPE2、DR5蛋白表达

8 流式细胞术检测转染后AA-FLS细胞中DR5的表达

9 Western blot检测细胞AKT、AKT(phospho)、NF-κBp105／p50(phospho)蛋白表达

10 Annexin V／PI流式细胞术检测抑制剂干扰后细胞凋亡

三、讨论

总结

参考文献

附录

致谢

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