雄激素剥夺状态下前列腺上皮细胞凋亡和自噬相互关系的研究

摘要

目的:本实验为研究剥夺雄激素条件下前列腺上皮细胞系BPH-1细胞凋亡与细胞自噬的相互关系、Beclin-1及其裂解片段与细胞凋亡过程的关系，验证在剥夺雄激素的同时抑制细胞自噬是否能够显著的提高BPH-1细胞的凋亡水平。
　　方法:BPH-1细胞传代过夜更换剥夺雄激素培养基培养0、4、8、12、16、20、24小时后提取总蛋白，western blot检测LC3-Ⅱ蛋白的表达评价早期细胞自噬水平的变化。剥夺雄激素培养基培养0、4、8、12、24、36、48小时后提取总蛋白，westem blot检测PARP-1蛋白的表达评价细胞凋亡水平的变化。剥夺雄激素培养基培养0、12、16、20、24、28、32小时后提取总蛋白，western blot检测PARP-1、LC3-Ⅱ、Caspase-3和Beclin-1蛋白的表达评价细胞凋亡和细胞自噬水平变化之间的关系，同时观察凋亡过程中Caspase-3的活化是否伴随着Beclin-1蛋白的水解。将BPH-1细胞分为正常对照组(Control)、雄激素剥夺组(AD)、抑制自噬组(AI)、剥夺雄激素+抑制自噬组(AD+AI)4个组。正常对照组:BPH-1细胞于含有10％胎牛血清和1×10-8mmol/L双氢睾酮的RPMI1640培养基中培养;剥夺雄激素组:BPH-1细胞于含有10％活性炭处理胎牛血清的无酚红RPMI1640培养基中培养;抑制自噬组:BPH-1细胞于含有10％胎牛血清、1×10-8mmol/L双氢睾酮和50μM氯喹的RPMI1640培养基中培养;剥夺雄激素+抑制自噬组:BPH-1细胞于含有10％活性炭处理胎牛血清和50μM氯喹的无酚红RPMI1640培养基中培养。细胞进行相应处理后24小时通过流式细胞术检测各组细胞凋亡水平。
　　结果:western blot结果显示:BPH-1细胞剥夺雄激素培养基中培养0、4、8、12、16、20、24小时，在0小时的时候LC3-Ⅱ蛋白即有一定水平的表达，从4～16小时LC3-Ⅱ表达水平明显提高(P＜0.05)，从20小时开始LC3-Ⅱ蛋白的表达量明显下降(P＜0.05)。BPH-1细胞剥夺雄激素培养基中培养0、4、8、12、24、36、48小时，在0～12小时的时候PARP-1蛋白表达水平无显著变化，24小时开始PARP-1蛋白表达水平显著降低(P＜0.001)并出现水解片段。BPH-1细胞剥夺雄激素培养基中培养0、12、16、20、24、28、32小时，LC3-Ⅱ蛋白在16小时之前表达水平是增加的，16小时之后LC3-Ⅱ蛋白的表达水平明显下降;PARP-1蛋白在16小时之前表达水平并无明显变化，16小时之后PARP-1蛋白的表达水平开始明显下降;从20小时开始Caspase-3蛋白表达水平明显下降，同时Beclin-1蛋白出现明显的35KD和37KD的水解片段。流式细胞术结果显示:与正常对照组相比，剥夺雄激素组、抑制细胞组、剥夺雄激素+抑制自噬组的细胞凋亡水平均显著增加(P＜0.01);与剥夺雄激素组或抑制自噬组相比较，剥夺雄激素+抑制自噬组均能够显著的增加前列腺上皮细胞的凋亡率(P＜0.001)。剥夺雄激素与抑制自噬存在协同作用(P＜0.05)。
　　结论:在剥夺雄激素条件下，前列腺上皮细胞BPH-1初期细胞自噬活化发挥细胞代偿功能，而后细胞自噬水平降低并细胞凋亡水平增加，细胞自噬和细胞凋亡表现为相互拮抗或相互抑制;细胞凋亡水平提高的过程中Caspase-3蛋白活化的同时Beclin-1蛋白出现裂解片段;细胞凋亡诱导Beclin-1蛋白裂解产生的Beclin1-C能够对细胞凋亡过程进行正反馈，这可能是剥夺雄激素治疗的机制所在。剥夺雄激素或者抑制细胞自噬均能够显著增加前列腺上皮细胞凋亡水平;剥夺雄激素与抑制细胞自噬能够产生协同作用进一步提高前列腺上皮细胞的凋亡水平。

目录

声明

摘要

1 绪论

1．1 细胞凋亡

1．2 细胞凋亡、雄激素与前列腺增生之间的关系

1．3 细胞自噬

1．4 自噬与细胞稳态

1．5 细胞凋亡和细胞自噬之间的相互联系

1．6 Beclin-1：一种具有同时调节细胞凋亡和细胞自噬潜能的蛋白

1．7 实验内容与意义

1．7．1 实验内容

1．7．2 研究意义

2 实验试剂与仪器

2．1 主要材料和试剂

2．2 主要实验仪器

2．3 主要溶液配方

2．3．1 药品的配制

2．3．2 实验主要的试剂配置

3 实验方法

3．1 细胞培养

3．1．1 细胞复苏

3．1．2 细胞传代

3．1．3 细胞冻存

3．2 western blot

3．2．1 细胞处理

3．2．2 制备细胞总蛋白样品

3．2．3 BCA法测定细胞总蛋白质的浓度

3．2．4 电泳

3．3 流式细胞术

3．3．1 细胞处理

3．3．2 Annexin V-FITC／PI细饱凋亡检测

3．3．3 流式细胞术结果分析

3．4 统计学分析

4 实验结果和分析

4．1 剥夺雄激素条件下BPH-1细胞自噬和凋亡相关蛋白的表达情况

4．1．1 剥夺雄激素条件下BPH-1细胞LC3-Ⅱ蛋白随时间变化的表达情况

4．1．2 剥夺雄激素条件下BPH-1细胞PARP-1蛋白随时间变化的表达情况

4．1．3 western blot检测剥夺雄激素条件下BPH-1细胞PARP-1和LC3-Ⅱ的表达水平随时间变化的趋势

4．1．4 western blot检测凋亡过程中Caspase-3的活化是否伴随着Beclin-1蛋白的水解

4．2 剥夺雄激素、抑制细胞自噬、剥夺雄激素+抑制细胞自噬对前列腺上皮细胞凋亡水平的影响

5 讨论

5．1 剥夺雄性激素条件下BPH-1细胞自噬和凋亡相关蛋白的表达分析

5．2 剥夺性雄激素、抑制细胞自噬对前列腺上皮细胞凋亡水平影响的分析

6 结论

6．1 结论

参考文献

致谢