VEGF-C及其受体NRP-2对血清剥夺诱导的肾小管上皮细胞凋亡与自噬的作用研究

摘要

目的：探讨血管内皮生长因 C(VEGF-C)在肾缺血再灌注动物模型中表达的变化以及VEGF-C及其受体NRP-2对血清剥夺诱导的大鼠近端肾小管上皮细胞（NRK52E）凋亡和自噬的作用及机制。
　　方法：（1）观察小鼠肾缺血再灌注模型中VEGF-C的表达变化：构建小鼠肾缺血再灌注模型，收集并检测各组血清总Scr，BUN的水平，PAS染色观察肾脏的病理损伤程度，免疫组织化学法及Western Blot检测VEGF-C的表达与分布。（2）观察VEGF-C及受体 NRP-2对血清剥夺诱导的肾小管上皮细胞凋亡的影响：血清剥夺不同时间刺激NRK52E细胞，Western Blot检测血清剥夺不同时间点激活型caspase3和总caspase3的表达变化；用小分子siRNA干扰技术分别沉默VEGF-C,NRP-2的表达，利用流式细胞学方法检测VEGF-C,NRP-2沉默对血清剥夺诱导细胞凋亡率的影响，Western Blot检测抗凋亡蛋白Bcl-2的表达变化；用不同浓度的重组VEGF-C因子预处理细胞，利用CCK-8法检测外源性加入VEGF-C对血清剥夺诱导的细胞活性改变的影响。（3）观察VEGF-C及受体NRP-2对血清剥夺诱导的肾小管上皮细胞自噬的影响：血清剥夺不同时间刺激NRK52E细胞，Western Blot检测血清剥夺不同时间点LC3的表达；细胞免疫荧光检测LC3表达及分布情况；透射电镜观察血清剥夺诱导后细胞的超微结构形态改变；用小分子siRNA干扰技术分别沉默VEGF-C,NRP-2的表达，Western Blot检测VEGF-C,NRP-2沉默对血清剥夺诱导LC3的表达变化的影响；在血清剥夺的条件下，加入不同浓度的巴伐洛霉素A1（Bafilomycin A1）,CCK-8法检测细胞活性的改变；Western Blot检测加入Bafilomycin A1后VEGF-C沉默对血清剥夺诱导LC3的表达变化的影响。
　　结果：（1）缺血再灌注损伤后，小鼠血肌酐和尿素氮上升，缺血再灌注24 h时肾功能损伤最明显，而缺血再灌注48 h时肾功能已经有部分恢复。与假手术组比较，缺血再灌注损伤后肾组织可见肾小管管腔扩张，伴管型形成，肾小管上皮细胞肿胀坏死及空泡变性，刷状缘坏死脱落，并且伴有炎性细胞侵润，而肾小球未见明显的病变。免疫组织化学结果显示，与假手术组比较，缺血再灌注24 h组小鼠肾脏VEGF-C表达增加，并且主要表达在肾脏皮髓质交界处及髓质部的肾小管。Western blot结果显示随着缺血后再灌注时间的延长，小鼠肾组织 VEGF-C蛋白的表达逐渐增加。（2）随着血清剥夺时间的延长，细胞激活型caspase3的表达增高，而总caspase3的表达减少；利用siRNA技术分别沉默NRK52E细胞VEGF-C和NRP-2的表达后，血清剥夺诱导的细胞凋亡水平均明显增加；血清剥夺刺激后，Bcl-2蛋白表达下降，而沉默VEGF-C能进一步降低Bcl-2蛋白的表达；外源性加入VEGF-C能抑制血清饥饿诱导的细胞活力下降。(3)随着血清剥夺时间的延长，LC3II蛋白的表达逐渐增加；血清剥夺诱导后LC3在胞浆点状聚集增多；透射电镜下观察到血清剥夺诱导后细胞线粒体肿胀，细胞内空泡变性显著增多，并可以见到降解自噬囊泡；分别沉默VEGF-C和NRP-2的表达后，能进一步增加血清剥夺诱导的LC3II的蛋白表达；在血清剥夺环境下，Bafilomycin A1能使细胞活力进一步降低，并呈浓度依耐性；加入Bafilomycin A1后，VEGF-C干扰组的细胞LC3表达变化的比值均低于对照siRNA组。
　　结论：肾缺血再灌注损伤后肾脏组织中VEGF-C的表达上升，提示VEGF-C与肾缺血再灌注损伤之间存在着密切的关系；VEGF-C及其受体NRP-2能维持肾小管上皮细胞在血清剥夺环境下的存活，减少肾小管上皮细胞凋亡；VEGF-C及其受体NRP-2参与调控血清剥夺诱导的细胞自噬。

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华中科技大学博士学位论文创新点概述

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前言

参考文献

第一部分 研究VEGF-C在急性肾缺血再灌注模型中的表达

材料和方法

实验结果

讨论

参考文献

第二部分 VEGF-C及其受体NRP-2对血清剥夺诱导肾小管上皮细胞凋亡的作用研究

材料和方法

实验结果

讨论

参考文献

第三部分 VEGF-C及其受体NRP-2对血清剥夺诱导肾小管上皮细胞自噬的作用研究

材料和方法

实验结果

讨论

参考文献

结论

综述: 自噬在急性肾损伤中的作用

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