乙肝病毒X蛋白羧基端对病毒复制和细胞死亡作用机制的研究

摘要

在全球范围内，肝细胞癌(HCC)是临床上最常见的恶性肿瘤之一。乙型肝炎病毒（HBV）的持续感染是引起HCC的高危因素。乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBx)对于HBV的复制和HBV相关肝癌的发生发展起着重要的作用。本研究从HBV相关肝癌患者的癌、癌旁组织标本和血清标本出发，发现HBV相关肝癌组织的低复制性与HBx羧基端的截短突变有相关性。先前也有研究表明HBx羧基端截短突变体对于HBV的复制水平又不同程度的影响，但是所涉及的亚细胞结构靶点及参与的作用机制尚未阐明。本研究通过体内外实验证实HBx蛋白羧基端对于HBV复制、细胞死亡和上调细胞质钙内流的重要性，并通过钙离子激动剂的补偿实验证实HBx蛋白羧基端通过上调细胞质钙内流促进HBV复制和细胞死亡。
　　通过免疫共沉淀实验和western blot检测细胞内caspase蛋白激活水平，阐明HBx羧基端介导的HBV复制和细胞死亡机制如下:其一，野生型HBx通过羧基端的类BH3结构域与Bcl-2相互结合，竞争性抑制了Bcl-2对InsP3Rs的相互作用，促进了InsP3R通道将钙离子从内质网释放到细胞质;其二，细胞质内钙内流的上调激活Pyk2激酶-Src激酶级联反应，促进HBV复制;同时，钙内流的上调诱导线粒体膜通透孔MPTP开放，启动线粒体依赖的细胞死亡通路，DNA片段破碎，细胞结构破坏，导致细胞死亡;其三，野生型HBx通过靶向于线粒体膜上的Bcl-2/Bcl-xl蛋白，促进Bak-Bax复合体的形成，促进MPT的介导的线粒体内钙离子流的释放;其四，羧基端截短型HBx由于失去了与Bcl-2相互结合的类BH3结构域，失去了与Bcl-2相互结合的能力，从而失去了介导Bcl-2依赖的内质网和线粒体钙离子流的释放，因而失去了诱导由此而引起的HBV的复制和细胞死亡的生物学效应。
　　本研究阐明的HBx/Bcl-2/InsP3Rs/MPTP/Ca2+信号通路可能成为治疗HBV相关肝病的潜在作用靶点，对于HBV的抗病毒治疗及预防进展为HBV相关肝癌带来新的曙光。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 乙型肝炎病毒

1．1．1 概述

1．1．2 HBV基因组结构和病毒颗粒

1．1．3 HBV的复制特征和生命周期

1．1．4 HBV病毒蛋白及功能

1．1．5 HBV与HCC的发生与发展

1．2 HBx基因的结构特点及其蛋白的生物学功能

1．2．1 HBx基因的结构特点

1．2．2 HBx蛋白的生物学功能

1．2．5 HBx与HCC的发生和发展

1．3 HBx的突变及意义

1．3．1 基本核心启动子(BCP)突变

1．3．2 核心上游调节序列(CURS)、负性调节元件(NRE)突变

1．3．3 增强子ll(Enhll)和直接重复序列1，2(DR1，DR2)突变

1．3．4 HBx基因突变与肝细胞癌研究进展

1．4 羧基端截短型HBx突变的研究现状

1．5 研究基础：HBx与Bcl-2相互结合介导HBV复制和细胞凋亡

1．5．1 Bcl-2家族和HBx的BH3结构域

1．5．2．HBx与Bcl-2相互结合介导HBV复制和细胞凋亡

1．6 本研究的研究目的及意义

第二章 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 乙肝病毒相关肝癌组织标本及其血液标本

2．1．2 细胞系

2．1．3 实验动物

2．1．4 质粒载体

2．1．5 试剂与药品

2．1．6 主要试剂的制备

2．1．7 主要设备仪器

2．2 实验方法

2．2．1 组织DNA及血清DNA的提取

2．2．2 组织和细胞蛋白提取

2．2．3 HBV全长序列及HBx序列的扩增及测序

2．2．4 DNA凝胶成像实验

2．2．5 质粒转化

2．2．6 质粒提取

2．2．7 质粒构建

2．2．8 小鼠尾静脉高压注射

2．2．9 细胞培养

2．2．10 细胞转染

2．2．11 稳转细胞株的构建

2．2．12 ELISA检测HBV相关抗原

2．2．13 免疫组化

2．2．14 实时荧光定量PCR

2．2．15 流式细胞凋亡检测

2．2．16 TUNEL凋亡细胞检测

2．2．17 细胞钙离子流成像实验及流式实验

2．2．18 荧光素酶报告基因实验

2．2．19 免疫共沉淀

2．2．20 Western blot

2．2．21 统计学分析

第三章 实验结果与分析

3．1 第一节 乙肝病毒相关肝癌组织病毒低复制性与HBx截短突变发生率相关

3．1．1 乙肝病毒相关肝癌组织病毒低复制性

3．1．2 乙肝病毒相关肝癌组织HBV DNA与癌旁和血清标本在进化上属于不同种属

3．1．3 HBx序列突变情况

3．1．4 HBX截短突变与乙肝病毒相关肝癌组织病毒低复制性的关系

3．1．5 讨论

3．2 第二节 HBx蛋白羧基端对乙肝病毒复制及细胞死亡的重要性

3．2．1 截短型HBx质粒的构建及稳转细胞株的建立

3．2．2 HBx羧基端对乙肝病毒复制的重要性

3．2．3 HBx羧基端对细胞死亡的重要性

3．2．4 讨论

3．3 第三节 HBx羧基端与细胞内钙内流及钙信号通路的关系

3．3．1 HBx羧基端与钙离子内流的关系

3．3．2 HBx羧基端对细胞内钙离子信号通路的关系

3．3．3 HBx羧基端引起的细胞内钙内流的上调是影响HBV复制和肝细胞凋亡的主要原因

3．3．4 讨论

3．4 第四节 HBx羧基端诱导钙内流的主要机理

3．4．1 野生型HBx与Bcl-2相互结合

3．4．2 野生型HBx与Bcl-2的结合竞争性抑制了Bcl-2与InsP3R的相互结合

3．4．3 截短型HBx失去与Bcl2的结合区域间接促进了Bcl-2与InsP3R的相互结合

3．4．4 钙内流上调引起的Caspase家族相关蛋白表达水平上调

3．4．5 讨论

第四章 总结与展望

4．1 总结

4．2 展望

第五章 缩略语及中英文对照

参考文献

致谢

第八章 在学期间发表的论文