小鼠角膜上皮祖细胞的抗氧化性与ROS系统相关性的研究

摘要

目的:活性氧(ROS)是体内产生的一种高活性分子，低浓度可以调节细胞代谢，基因转录和磷酸酶的活性，高浓度则会导致氧化损伤。目前，有关干细胞自身特性的研究越来越受到学者们的重视，但既往文献中关于干细胞对氧化应激反应以及应激条件下细胞内相关酶活性的变化规律却很少报道。本课题聚焦于，在过氧化氢(H2O2)诱导的氧化应激条件下，活性氧生成关键因子NOX4和抗氧化酶核转录因子NRF2在小鼠角膜上皮祖细胞(TKE2)和成熟的小鼠角膜上皮细胞(MCE)中的不同作用及相关机制。
　　方法:利用小鼠角膜上皮祖细胞（TKE2）和成熟小鼠角膜上皮细胞(MCE)建立过氧化氢(H2O2)诱导的氧化应激细胞模型。首先我们通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、免疫荧光染色法、免疫印迹和mRNA基因芯片检测技术比较了几种不同的类干细胞标志物在这两种细胞中的表达性差异。通过CCK8实验检测H2O2对这两种细胞的活性影响。通过流式细胞术检测细胞内的ROS水平，采用免疫荧光染色和免疫印迹的方法分别检测两种细胞内氧化应激标志物3-硝基酪氨酸(3-NT)的含量，并检测细胞内ROS清除剂超氧化物歧化酶(SOD)的活性。在机制研究方面，利用荧光定量PCR(qRT-PCR)、免疫荧光染色和免疫印迹方法检测了ROS重要生成酶NADPH氧化酶4(NOX4)、双向特异性磷酸酯酶6(DUSP6)和核转录因子NRF2的表达水平，同时，也检测了基础状态下，NOX4和NRF2在两种不同细胞中的含量表达差异。此外，应用RNA干扰技术和药理NOX4激动剂—佛波醇-12-十四酸酯-13-乙酸酯(TPA)来佐证H2O2条件下细胞中ROS关键因子的变化情况。
　　结果:细胞鉴定结果表明，TKE2细胞的三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2(ABCG2)、神经性钙粘附素(N-cadherin)等类干细胞标志物的表达水平明显高于MCE细胞，且基因PAX6（类细胞分化标志物）含量显著低于MCE细胞。随着H2O2浓度的增高，TKE2细胞的细胞活性持续维持在较高水平，而其对MCE细胞的细胞活性则具有明显的抑制作用，并呈浓度依赖性。在H2O2诱导的氧化应激条件下，TKE2细胞中ROS水平下降、3-NT表达含量减少，但SOD活性增强;而在MCE细胞中，ROS水平和3-NT表达含量增强，而SOD活性降低。H2O2下调TKE2细胞中ROS重要生成酶NOX4的水平，升高DUSP6的含量，显著提高NRF2的表达水平，并在加入激动剂TPA时，NOX4表达量明显上升;而在MCE细胞中，H2O2则上调ROS重要生成酶NOX4的水平，降低DUSP6和NRF2的表达量，且在转入小分子干扰RNA时NOX4水平显著下调。
　　结论:经验证，小鼠角膜上皮祖细胞(TKE2)较成熟小鼠角膜上皮细胞(MCE)而言具有干细胞特性。和MCE细胞相比，TKE2细胞具有较强的抗氧化应激特性;其作用机制是抑制ROS氧化产物的生成，下调ROS重要生成酶NOX4的表达，激活抗氧化应答并上调ROS清除剂超氧化物歧化酶SOD的表达水平。本研究发现，小鼠角膜上皮祖细胞(TKE2)呈现出不同的细胞内稳态和抗氧化应激特性，为角膜干/祖细胞在今后临床疾病的治疗和移植以及其他方面的应用提供了一定的思路和方向。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 氧化应激

1．1．1 氧化应激概念

1．1．2 氧化应激状态的评价

1．1．3 氧化应激与ERK信号通路

1．1．4 氧化应激在眼科疾病研究中的最新进展

1．1．5 氧化应激与细胞衰老

1．2 NADPH氧化酶4的特性

1．2．1 NOX4的基本结构与组织、细胞内的分布

1．2．2 NOX4的活化

1．2．3 NOX4相关信号传导通路

1．2．4 NOX4与相关疾病

1．3 角膜上皮干细胞

1．3．1 角膜上皮干细胞的概念与生物标志物

1．3．2 ROS调节干细胞特性

第二章 实验材料

2．1 实验材料与仪器

2．1．1 细胞系和实验动物

2．1．2 实验试剂

2．1．3 实验仪器

2．2 主要溶液配制

2．2．1 细胞培养相关溶液

2．2．2 细胞裂解液

2．2．3 Western Blot实验溶液

2．2．4 免疫荧光实验溶液

第三章 实验方法

3．1 细胞培养

3．1．1 细胞的复苏

3．1．2 MCE细胞的获取方法

3．1．3 细胞的传代

3．1．4 细胞的冻存

3．1．5 细胞的计数与种板

3．1．6 细胞爬片的制作

3．1．7 细胞的过氧化氢H2O2及激动剂TPA处理

3．1．8 MCE细胞的小干扰RNA细胞转染

3．2 CCK-8法测定细胞活性

3．3 流式细胞术检测细胞内ROS水平

3．4 免疫荧光染色

3．5 免疫印迹实验

3．5．1．TKE2和MCE细胞总蛋白提取

3．5．2 蛋白定量与样品制备

3．5．3 电泳分离

3．5．4 转膜

3．5．5 免疫反应与显影

3．5．6 膜再生

3．6 实时荧光定量PCR

3．6．1 RNA提取

3．6．2 逆转录

3．6．3 实时荧光定量PCR

3．7 mRNA基因芯片分析

3．8 统计学分析

第四章 实验结果

4．1 H2O2诱导小鼠角膜上皮细胞的氧化应激作用

4．1．1 不同浓度的H2O2对细胞活性的影响

4．1．2 H2O2在不同时间点对细胞活性的影响

4．1．3 H2O2诱导细胞中的氧化应激

4．2 验证TKE2细胞的干细胞鉴定

4．2．1 细胞形态比较

4．2．2 细胞中不同生物标记物的表达差异

4．3 H2O2诱导小鼠角膜上皮细胞氧化应激的机制研究

4．3．1 在正常条件下，ROS关键因子的基础表达水平

4．3．2 H2O2调节细胞中活性氧ROS的生成

4．3．3 H2O2调节细胞中磷酸酯酶DUSP6的变化

4．3．4 H2O2调节细胞中的核转录因子NRF2的含量变化

第五章 讨论

第六章 总结

参考文献

在学期间科研成果

附录

致谢