ROS信号通路在小鼠角膜上皮祖细胞(TKE2)的抗氧化细胞特性中的作用以及分子机制的研究

摘要

目的:目前ROS在干细胞生物学中的作用还没有得到充分说明和了解。在过氧化氢(H2O2)诱导的氧化应激条件下，我们比较小鼠角膜上皮祖细胞(TKE2)[1]和成熟的小鼠角膜上皮细胞(MCE)的不同反应，重点研究是角膜干细胞的抗氧化细胞特性及相关机制。
　　方法:以小鼠角膜上皮祖细胞(TKE2)和成熟的小鼠角膜上皮细胞(MCE)为细胞模型，通过CCK8细胞活性实验检测不同浓度H2O2对小鼠角膜上皮的祖细胞(TKE2)和成熟的小鼠角膜上皮细胞(MCE)的影响。利用H2O2处理细胞24小时后，通过流式细胞术检测细胞内ROS的水平，利用免疫荧光染色检测细胞内氧化应激标志物3-硝基酪氨酸(3-NT)表达情况，通过实时定量PCR(qRT-PCR)、免疫荧光染色、免疫印迹等方法检测细胞主要Keap1-Nrf2-ARE抗氧化信号通路及细胞自噬水平的激活情况。往培养基中加入5％胎牛血清，得到分化的TKE2细胞。在H2O2处理24小时后，通过检测分化的TKE2细胞内ROS产生关键酶-NOX4及细胞主要Keap1-Nrf2-ARE抗氧化信号通路的激活情况，进一步论证TKE2具有一定的抗氧化性质。
　　结果:细胞活性实验结果显示，在相同应激条件下，TKE2细胞则表现出较强的拮抗作用，而MCE细胞存活受到抑制，且呈浓度依赖关系。活性氧（ROS）实验测定与ROS标记物3-NT结果显示，在相同应激条件下，TKE2细胞内ROS/3-NT表达降低，而MCE细胞内ROS/3-NT表达升高;相关抗氧化性机制研究表明（相同应激条件），TKE2细胞内重要抗氧化应激信号通路的Keap1-Nrf2-ARE被激活，而MCE细胞内应答较低。另一方面，H2O2诱导4小时后，TKE2细胞中相关自噬标志物:Beclin1，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均上调，而P62蛋白表达下调;MCE细胞中Beclin1，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均下调，而P62蛋白表达上调。结果提示在氧化应激的早期阶段，TKE2细胞中自噬被激活，而MCE细胞的自噬未被激活或被抑制。而在H2O2诱导24小时后，未观察到TKE2和MCE细胞中自噬的明显改变。TKE2细胞与分化后的TKE2细胞比较结果证实:H2O2处理分化的TKE2细胞24小时后，测定细胞内ROS产生关键酶-NOX4表达升高，且重要抗氧化应激信号通路Keap1-Nrf2-ARE未被激活，提示TKE2干细胞具备一定的抗氧化性质。
　　结论:在H2O2诱导的氧化应激条件下，小鼠角膜上皮祖细胞TKE2较成熟小鼠角膜上皮MCE细胞具有显著的抗氧化应激细胞特性，其机制是较强地激活抗氧化应激信号通路Keap1-Nrf2-ARE及早期自噬而实现的。结果首次提示角膜干细胞具有较强的抗氧化能力，对角膜干细胞以及其他干细胞的治疗及其他应用具有潜在的意义。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 氧化应激

1．1．1 氧化应激简述

1．1．2 氧化应激与眼科疾病的进展

1．1．3 氧化应激模型的建立

1．1．4 氧化应激相关蛋白阐述

1．2 抗氧化应激信号通路

1．2．1 Keap1-Nrf2-ARE信号通路

1．2．2 Nrf2与眼科疾病进展

1．2．3 Keap1-Nrf2- ARE信号通路其他信号通路关系

1．3 氧化应激与自噬研究进展

1．3．1 自噬的简述

1．3．2 氧化应激与自噬关系

1．3．3 ROS介导自噬相关的眼科疾病

第二章 实验材料

2．1 实验材料与仪器

2．1．1 细胞

2．1．2 实验试剂

2．1．3 实验仪器

2．1．4 主要溶液配

第三章 实验方法

3．1 细胞培养

3．1．1 细胞的复苏

3．1．2 细胞的传代

3．1．3 细胞的冻存

3．1．4 细胞计数及种板

3．1．5 细胞爬片的制作

3．1．6 TKE2／MCE细胞的H2O2处理

3．1．7 TKE2／MCE细胞SFN处理及NRF2 siRNA转染

3．2 CCK-8法测定细胞的活性

3．3 流式细胞术检测细胞内ROS的水平

3．4 免疫荧光染色

3．5 免疫印迹实验(Western Blotting)

3．6 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

3．7 基因芯片

3．8 统计学分析

第四章 结果

4．1 H2O2诱导小鼠角膜上皮祖细胞(TKE2)／小鼠成熟角膜上皮细胞(MCE)

4．1．1 H2O2对TKE2／MCE细胞活性的影响

4．1．2 H2O2诱导TKE2／MCE细胞氧化应激

4．1．3 H2O2诱导TKE2／MCE细胞抗氧化应激的作用机制研究

4．1．4 H2O2诱导TKE2／MCE细胞自噬作用研究

4．2 H2O2诱导小鼠角膜上皮祖细胞TKE2分化前后的研究

4．2．1 H2O2诱导小鼠角膜上皮祖细胞TKE2分化前后细胞形态的影响

4．2．2 H2O2诱导分化的TKE2相关干细胞标记物表达减弱

4．2．3 H2O2诱导分化的TKE2细胞氧化应激的作用机制研究

第五章 讨论

第六章 总结

参考文献

缩写索引

在学期间科研成果

致谢