梅毒螺旋体激活NLRP3炎症复合体诱导THP-1细胞分泌IL-1β的途径研究

摘要

背景:梅毒螺旋体（Treponema pallidum，Tp）是性传播疾病梅毒的病原体。梅毒螺旋体的研究已经近一个多世纪，尽管对其生物学特性有了一定的认识，然而有关梅毒螺旋体的致病机制仍知之甚少。NLRP3(NACTH domain-leucine-rich repeat，and PYD-containing protein，NLRP3)炎症复合体能被多种激活剂所激活，通过活化半胱氨酸蛋白酶-1(casepase-1)影响IL-1β的分泌，调节免疫应答和炎症反应，在机体对抗病原微生物的天然免疫中起着重要作用。本研究探讨Tp诱导THP-1（人单核细胞）来源巨噬细胞中NLRP3炎症复合体的活化作用，阐明活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的产生、K离子浓度或组织蛋白酶B的释放是Tp诱导NLRP3炎症复合体活化的关键因素，为Tp感染的防治提供理论和实验依据。
　　方法:我们以THP-1来源的巨噬细胞为模型，按照MOI(感染复数)为200∶1，100∶1，50∶1，20∶1将Tp与巨噬细胞共培养，分别于0h，3h，6h，12h，24h收集细胞及上清液，Realtime-PCR检测细胞中IL-1β、NLRP3、caspase-1mRNA的表达，Westernblot检测细胞中IL-1β、caspase-1蛋白的表达，ELISA检测细胞上清中IL-1β的含量。采用caspase-1抑制剂YVAD-FMK预处理THP-1细胞，观察YVAD-FMK对Tp诱导的IL-1β分泌的影响。然后分别用25 mM ROS抑制剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)、100 mMKC1或30μM组织蛋白酶B抑制剂CA-074 Me预处理THP-1细胞30min，Tp刺激后Realtime-PCR、Western blot及ELISA检测相关信号分子的表达。
　　结果:不同浓度的Tp能使巨噬细胞产生IL-1β，且IL-1β的产生水平与MOI呈明显的浓度依赖性，用MOI为50∶1的Tp刺激THP-1细胞后IL-1β的分泌水平在4h达到最高(P＜0.05); Realtime-PCR及Westernblot结果发现Tp刺激能使细胞中NLRP3、caspase-1 mRNA及caspase-1蛋白水平表达升高;caspase-1的抑制剂YVAD-FMK预处理THP-1细胞后发现IL-1β的分泌与表达显著降低;最后经NAC、KC1或CA-074 Me预处理巨噬细胞后，发现Tp诱导IL-1β的分泌也被显著的抑制。
　　结论:以上结果表明，Tp诱导THP-1细胞分泌IL-1β与NLRP3炎症复合体的活化有关，而ROS、K+外流、组织蛋白酶B的释放在此激活过程中发挥重要作用。

目录

声明

摘要

中英文缩略词表

第一章 绪论

1．1 梅毒的概述

1．1．1 梅毒的流行现状

1．1．2 Tp的生物学特点

1．1．3 Tp的致病性

1．1．4 梅毒的免疫学特点

1．1．5 梅毒的诊断方法

1．2 NLRP3炎症复合体的研究进展

1．2．1 NLRP3炎症复合体概述

1．2．2 NLRP3炎症复合体的激活途径

1．2．3 NLRP3炎症复合体的抗感染免疫

第二章 实验材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验对象

2．1．2 主要试剂

2．1．3 实验主要仪器

2．1．4 主要试剂的配制

2．1．5 实验所用器具的处理

2．2 实验方法

2．2．1 细胞培养与传代

2．2．2 Tp感染THP-1来源巨噬细胞模型的建立

2．2．3 荧光定量PCR方法检测细胞因子mRNA水平表达量

2．2．4 ELISA检测细胞上清液中细胞因子的表达量

2．2．5 流式细胞仪检测Tp诱导THP-1细胞ROS的水平

2．2．6 ROS抑制后检测细胞ROS的水平

2．2．7 Western blot检测细胞中IL-1β和caspase-1的表达

2．2．8 统计学处理

第三章 实验结果

3．1 Tp在兔睾丸中的繁殖及鉴定

3．1．1 兔睾丸组织接种Tp后的炎症情况

3．1．2 暗室野显微镜观察Tp

3．2 Tp诱导IL-1β分泌和表达

3．2．1 不同浓度Tp剌激THP-1来源的巨噬细胞产生IL-1β

3．2．2 不同时间段Tp剌激THP-1来源的巨噬细胞产生IL-1β

3．3 Tp诱导成熟IL-1β的分泌过程中NLRP3炎症复合体的活化

3．3．1 Tp剌激巨噬细胞后能活化NLRP3炎症复合体

3．3．2 caspase-1抑制剂对NLRP3炎症复合体的活化的影响

3．4 Tp诱导NLRP3复合体活化的途径

3．4．1 ROS途径

3．4．2 K离子外流途径

3．4．3 溶酶体半胱氨酸蛋白酶B释放途径

第四章 讨论

4．1 NLRP3炎症复合体在抗感染免疫中的作用

4．2 Tp诱导促炎因子IL-1β的分泌与表达

4．3 Tp诱导成熟IL-1β的分泌依赖于NLRP3炎症复合体的活化

4．4 Tp诱导NLRP3炎症复合体活化模型

第五章 结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间的研究成果