诱导型hRPS23RG1转基因小鼠的构建与表型研究

摘要

阿尔兹海默病(Alzheimer's disease，AD)是一种最普遍的、与年龄密切相关的神经退行性疾病。小分子蛋白多肽Aβ在大脑中的聚集和微管相关蛋白Tau的异常过度磷酸化是导致AD发病至关重要的原因。Aβ是由其前体蛋白APP被β-分泌酶BACE1和γ-分泌酶复合体依次水解后所释放，具有神经毒性，可以导致神经细胞死亡。Tau在正常生理状态下，维持微管的稳定。Tau蛋白可以被糖原合成酶激酶3β(Glycogen synthase kinase3β，GSK-3β)等蛋白激酶磷酸化。但异常过度磷酸化的Tau蛋白会聚集成双股螺旋细丝，再进一步形成神经元纤维缠结。Tau蛋白神经纤维缠结破坏了微管的稳定性，导致正常轴突转运障碍、神经元突触受损和神经元功能丧失。因此，鉴定参与Aβ产生和Tau蛋白异常磷酸化的新基因蛋白并阐明其作用机制，将有助于AD的治疗研发。
　　Rps23rg1是在小鼠中新近鉴定的一个基因，其蛋白RPS23RG1能够通过与腺苷酸环化酶相互作用，促进蛋白激酶PKA的活性，进而影响GSK-3β的活性以及Aβ的产生和Tau蛋白的磷酸化。我们实验室最近鉴定出人RPS23RG1基因，并发现人RPS23RG1（hRPS23RG1）蛋白具有与鼠源蛋白相似的功能。在本研究中，我们构建了诱导型的hRPS23RG1转基因小鼠，通过与Camk2-Cre小鼠杂交后，获得在大脑中表达hRPS23RG1的后代。初步的行为学研究发现，在大脑中过表达hRPS23RG1可以增加小鼠的活动，并具有促进小鼠学习与记忆能力的趋势。此外，过表达hRPS23RG1在小鼠大脑中和体外培养的神经元中都增加了PSD95的蛋白水平。另外，虽然BACE1也可以与腺苷酸环化酶相互作用，但我们的研究没有发现hRPS23RG1能够与BACE1相互作用，也不影响BACE1的蛋白水平。这些工作为今后研究AD疾病过程中，RPS23RG1在不同组织和细胞类型中的功能作用，提供了物质基础。

目录

声明

摘要

缩略词

第一章 前言

1．1 阿尔兹海默症

1．1．1 阿尔兹海默症的研究概况(Alzheimer’s disease，AD)

1．1．2 阿尔兹海默症的病理特征

1．1．3 阿尔兹海默症发病的分子机制

1．2 APP及其功能

1．2．1 APP的水解加工

1．2．2 α-分泌酶

1．2．3 β-分泌酶

1．2．4 γ-分泌酶

1．2．5 Caspase的水解加工

1．2．6 Aβ的病理及生理功能

1．3 小鼠基因组中Rps23rg1基因的发现及其功能研究进展

1．4 RPS23RG研究进展

1．5 本论文研究的内容与意义

1．6 本文的研究主要解决以下问题

第二章 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 培养基、抗体、试剂和化学药品

2．1．2 动物、细胞株、菌种及质粒

2．1．3 主要试剂配制

2．1．4 实验仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 hRPS23RGL基因克隆

2．2．2 质粒大量提取

2．2．3 细胞培养

2．2．4 TurboFect Transfection Reagent转染

2．2．5 抗体的纯化

2．2．6 蛋白质免疫印迹分析

2．2．7 小鼠脑组织样品制备

2．2．8 细胞RNA提取

2．2．9 实时荧光定量PCR

2．2．10 免疫共沉淀

2．2．11 鼠基因鉴定

2．2．12 腺相关病毒的包装及纯化

2．2．13 AAV病毒感染细胞实验

2．2．14 动物行为学实验

2．3 数据统计

第三章 结果与分析

3．1 hRPS23RG1在人脑和小鼠不同神经细胞系中的表达水平

3．2 hRPS23RG1和BACE1没有相互作用，也不影响BACE1蛋白的表达水平

3．3 小鼠原代神经元中过表达hRPS23RG1增加PSD95的蛋白水平

3．4 hRPS23GR1转基因小鼠的构建和鉴定

3．5 hRPS23RG1基因表达不影响小鼠的体重

3．6 hRPS23RG1的表达对于小鼠活动的影响

3．7 hRPS23RG1的表达对于小鼠记忆能力的影响

3．8 hRPS23RG1-1／Camk2-Cre小鼠脑组织中GSK3-β磷酸化水平和PSD95蛋白的表达水平增加

第四章 讨论与展望

参考文献

致谢

在学期间发表论文