噁唑烷酮类NAAA抑制剂抗中枢炎症的药效评价与机制研究

摘要

研究背景:目前研究证明在多种中枢系统疾病中都存在炎症过程，学界普遍认可中枢系统炎症与胶质细胞过度激活有关。N-棕榈酰乙醇胺(N-palmitoylethanolamide，PEA)是一种近年来备受关注的内源性脂质，多项临床研究及基础研究证明，PEA可以通过激活PPAR-α有效抑制中枢胶质细胞的活化，缓解多种中枢系统性疾病。可以通过抑制PEA特异性水解酶N-酰基乙醇胺（NAAA）的活性提高体内PEA的水平，为治疗中枢炎症提供有效策略。然而，由于缺乏NAAA敲除鼠和生物学稳定的NAAA抑制剂，NAAA-PEA途径在中枢的作用和机制目前尚不清楚。
　　目的:通过课题组前期设计合成的新型噁唑烷酮类NAAAA抑制剂F96，初步评价抗中枢炎症药效与机制，为临床治疗中枢炎症相关疾病提供新的治疗靶标，同时也为发展具有自主知识产权的创新药物奠定理论和实验基础。
　　方法:以F96为工具药物，通过建立LPS诱导RAW264.7巨噬细胞、小鼠腹腔原代巨噬细胞以及小鼠原代小胶质细胞炎症模型，TPA诱导的小鼠耳肿胀炎症模型和LPS诱导小鼠系统性炎症模型，使用Real-Time PCR法和ELISA法检测炎症因子的表达，评价NAAA抑制剂在外周与中枢的抗炎作用;使用LC-MS检测机体内F96分布、内源性脂质的含量变化、评价NAAA活性，研究F96对内源性脂质及其代谢酶的影响;使用Western Blot检测脑内GFAP、PPAR-α和TLR-4等蛋白表达，使用免疫荧光检测脑内Iba-1蛋白的表达，使用PPAR-α基因敲除鼠，研究NAAA-PEA-PPAR-α途径对中枢炎症的作用与机制。
　　结果:F96能够有效抑制LPS诱导的RAW246.7巨噬细胞与小鼠腹腔原代巨噬细胞炎症因子TNF-α与IL-6基因与蛋白的表达;F96可以有效抑制LPS诱导的系统性炎症与TPA诱导的小鼠炎性耳肿胀并降低促炎性因子的表达，在外周与中枢系统均可以发挥抗炎作用;F96在机体内主要分布在NAAA高表达的外周系统，但可以通过血脑屏障，在脑内有一定分布;F96可以提高中枢PEA水平，提高PPAR-α表达，下调TLR-4蛋白，发挥抗炎作用;在PPAR-α敲除鼠中F96抗中枢炎症的作用完全消失，表明了PPAR-α介导了F96的抗炎作用，同时荧光素酶报告基因和蛋白结合实验证明，F96不是PPAR-α的直接激动剂;F96在机体内对其他内源性脂质AEA、2-AG与OEA没有显著影响，可避免不必要的中枢副作用;F96能够显著降低GFAP和Iba-1以及LPS诱导的原代小胶质细胞炎症因子的表达。
　　结论:F96在细胞和动物水平均具有较强的抗炎作用，并且首次发现NAAA抑制剂可以有效抑制中枢炎症反应;F96抗中枢炎症的机制是通过抑制NAAA活性，提高自身分泌的内源性PEA水平，调控PPAR-α受体及其下游信号通路，抑制胶质细胞自身活化，从而缓解中枢炎症。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 中枢炎症及其治疗药物

1．1．1 中枢炎症

1．1．2 中枢炎症的治疗药物

1．2 内源性脂质的药理学作用

1．2．1 N-棕榈酰乙醇胺(N-palmitoylethanolamide，PEA)抗炎作用研究进展

1．2．2 其他内源性脂质的生理功能

1．3 N-酰基乙醇胺水解酶(N-acylethanolamide hydrolyzing acid amidase，NAAA)

1．3．1 NAAA的发现与研究简介

1．3．2 NAAA抑制剂的研究现状

1．4 立题依据

参考文献

第二章 噁唑烷酮类NAAA抑制剂F96抗炎药效与作用部位研究

2．1 前言

2．2 F96抑制LPS诱导的RAW264．7细胞炎症模型

2．2．1 仪器与试剂

2．2．2 实验方法

2．2．3 实验结果与讨论

2．3 F96对LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞炎症反应的作用

2．3．1 仪器与试剂

2．3．2 实验方法

2．3．3 实验结果与讨论

2．4 腹腔注射F96对LPS诱导小鼠炎症模型的作用

2．4．1 仪器与试剂

2．4．2 实验方法

2．4．3 实验结果与讨论

2．5 腹腔注射F96在体内的分布研究

2．5．1 仪器与试剂

2．5．2 实验方法

2．5．3 实验结果与讨论

2．6 侧脑室注射F96抑制LPS诱导的小鼠中枢炎症模型

2．6．1 试剂与仪器

2．6．2 实验方法

2．6．3 实验结果与讨论

2．7 侧脑室注射F96抑制TPA诱导的局部炎症模型

2．7．1 仪器与试剂

2．7．2 实验方法

2．7．3 实验结果与讨论

2．8 本章小结

参考文献

第三章 噁唑烷酮类NAAA抑制剂F96在中枢炎症中的机制研究

3．1 前言

3．2 F96对内源性脂质的影响

3．2．1 试剂与仪器

3．2．2 实验方法

3．2．3 实验结果与讨论

3．3 PPAR-α介导了F96对中枢炎症的抑制作用

3．3．1 试剂与仪器

3．3．2 实验方法

3．3．7 实验结果与讨论

3．4 F96对NAAA活性的影响

3．4．1 试剂与仪器

3．4．2 实验方法

3．4．3 实验结果与讨论

3．5 胶质细胞在F96抑制中枢炎症中的作用

3．5．1 试剂与仪器

3．5．2 实验方法

3．5．6 实验结果的统计学处理

3．5．7 实验结果与讨论

3．6 本章小结

参考文献

第四章 全文总结

本人在硕士期间发表的论文

缩略语

致谢