Cdk5通过磷酸化调控FOXO1和BAG3对神经细胞死亡和突触功能紊乱的作用与机制研究

摘要

细胞周期蛋白依赖性激酶5(Cyclin-dependent kinase5，Cdk5)是由脯氨酸介导的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其在神经系统中发挥着重要的作用。Cdk5的活化主要靠神经系统中广泛表达的两个激活因子p35和p39。Cdk5对神经系统的正常生理功能具有重要作用，Cdk5通过磷酸化众多底物的丝氨酸/苏氨酸位点，在神经元的迁移分化，突触传递，轴突树突的发育过程以及神经元的存活中发挥着重要的作用。此外，在一些病理条件下，Calpain所介导的p35切割形成p25，可以过度激活Cdk5，诱导神经元凋亡和突触功能的紊乱，介导了多种神经退行性疾病的发生发展，暗示着Cdk5很可能成为治疗神经退行性疾病的重要靶点。在本文，我们重点阐述了Cdk5通过磷酸化FOXO1和BAG3在神经元存活和突触功能的重要作用及其调控机制。
　　在大脑的发育过程中，Cdk5的缺失会导致神经元的死亡。氧化应激(H2O2)和神经毒性(Aβ)的外界刺激下，p35切割形成p25，过度激活了Cdk5，进而诱导Cdk5可以磷酸化转录因子FOXO1的Ser249位点。FOXO1-Ser249的磷酸化促使FOXO1出核并抑制其转录活性。Cdk5的缺失可以抑制AKT的活性，并最终诱导FOXO1入核，触发其下游促凋亡基因Bim的表达，导致神经元的凋亡，但在细胞质定位的FOXO1-S249D突变可以缓解此过程。我们该项的研究发现了Cdk5通过调节FOXO1的亚细胞定位在神经元的退化过程中发挥着重要的作用。而这为我们提供了一种全新的视野去探究缺失Cdk5所诱导的神经元凋亡的调控机制。
　　ERK作为MAPKs家族的重要成员之一，其也可以参与调控FOXO1。激活的ERK1/2能够磷酸化FOXO1，并提高FOXO1的转录活性。而当加入MEK的抑制剂，其可抑制FOXO1的转录活性，促进其降解，并抑制其下游靶基因的转录表达。而ERK对FOXO1的调控并不依赖AKT。这就为我们深入了解FOXO1的功能提供了新的理论基础。
　　除此之外，我们关注研究Cdk5的另一个全新的底物BAG3，Cdk5可以在体内外磷酸BAG3的Ser291位点。而且，BAG3通过BAG结构域和P25直接相互作用。最近有研究表明BAG3有可能在神经突触中定位，但对其潜在功能还没有报道。为了探究BAG3对神经突触功能的影响，我们在新生鼠的侧脑室中注射AV2/8-shbag3病毒进而降低小鼠大脑中的BAG3蛋白水平，我们发现BAG3缺失以后，小鼠大脑皮层神经元的树突棘数目明显减少。伴随着树突棘的减少，敲低BAG3的小鼠的学习和认知功能都严重受损。同时在体外培养的神经元敲低BAG3，抑制了突触前(Synaptophysin，Synapsin)和突触后（NMDA受体，AMPA受体和PSD95）的蛋白表达，而且通过染色发现Synapsin和Synaptophysin在树突上的密度都显著降低。通过此项研究，我们发现了BAG3是Cdk5的一个全新底物，而且敲低BAG3能够导致树突棘数目减少，学习记忆和认知功能障碍。
　　综上所述，我们的研究表明了Cdk5通过磷酸化其底物在神经元死亡和突触功能发面发挥着重要的作用。这为进一步深入研究治疗神经退行性疾病提供了新的机制和药物开发靶点。

目录

声明

摘要

英文缩写中英文对照表

第一章 前言

1．1 细胞周期依赖性蛋白激酶5(Cyclin-dependent kinase 5，Cdk5)

1．1．1 概述

1．1．2 Cdk5及其活性调控

1．1．3 Cdk5的激活因子p35与p39

1．1．4 p35与p39的切割形式对Cdk5活性的调节

1．1．5 Cdk5在神经系统中的作用

1．1．6 Cdk5在神经元存活和死亡中的作用

1．1．7 细胞核Cdk5的功能及其与细胞周期的关系

1．1．8 Cdk5在神经突触功能的作用机制研究

1．2 FOXO1的研究现状

1．2．1 FOXO1家族的分类和分子结构特点

1．2．2 FOXO1的翻译后修饰

1．2．3 FOXO1在神经系统中功能研究

1．3 BAG3的研究现状

1．3．1 BAG3简介

1．3．2 BAG3在神经系统的功能研究

1．4 本文研究的内容和意义

第二章 实验材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 细胞系和菌株

2．1．2 质粒和siRNA

2．1．3 实验动物

2．1．4 抗体和其他试剂

2．1．5 腺相关病毒，慢病毒

2．1．6 GST相关蛋白

2．2 主要仪器

2．3 实验方法

2．3．1 原代神经元培养

2．3．2 免疫印迹(Western blot)

2．3．3 免疫荧光

2．3．4 荧光素酶双报告基因检测

2．3．5 亚细胞组分分离

2．3．6 免疫共沉淀

2．3．7 GST-pμll down

2．3．8 GST蛋白提取

2．3．9 体外激酶活性实验

2．3．10 快速点突变的质粒构建

2．3．11 新生鼠病毒注射

2．3．12 高尔基染色

2．3．13 突触前突触后蛋白分离

2．3．14 动物行为学实验

2．3．15 数据统计

第三章 Cdk5通过调节FOXO1的亚细胞定位介导神经元的凋亡机制研究

3．1 Cdk5与FOXO1相互作用且特异磷酸化Ser249-FOXO1位点

3．1．1 Cdk5特异磷酸化FOXO1的Ser-249位点

3．1．2 Cdk5，p35与FOXO1的相互作用

3．1．3 Cdk5抑制FOXO1的转录活性

3．2 Cdk5诱导FOXO1出核

3．2．1 Cdk5促进FOXO1与14-3-3β相互作用

3．2．2 氧化应激激活的Cdk5诱导了FOXO1的出核

3．2．3 Roscovitine诱导FOXO1的入核

3．2．4 H2O2，Aβ通过激活Cdk5调节FOXO1的活性

3．3 Ser249位点的磷酸化削弱了AKT抑制剂对FOXO1的定位调控

3．4 Cdk5促进FOXO1出核并不依赖于AKT-FOXO1信号调节通路

3．5 Cdk5抑制FOXO1转录活性不依赖AKT-FOXO1的信号调节通路

3．6 缺失Cdk5，诱导FOXO1入核，提高其转录活性

3．7 缺失Cdk5通过抑制AKT的活性诱导FOXO1入核

3．8 Cdk5在神经细胞周期和神经细胞凋亡方面的作用

3．9 以FOXO1为靶点，探究延缓神经元凋亡的潜在药物

3．10 讨论与展望

第四章 ERK磷酸化FOXO1的作用机制研究

4．1 细胞外调节蛋白激酶(ERK)磷酸化FOXO1

4．2 抑制ERK显著降低FOXO1的转录活性

4．3 抑制ERK活性显着降低FOXO1的蛋白水平

4．4 ERK对FOXO1转录活性的调节不依赖于AKT

4．5 ERK对FOXO1蛋白水平的调节并不依赖于AKT

4．6 ERK并不影响FOXO1的亚细胞定位

4．7 ERK的抑制通过去磷酸化FOXO1促进其降解

4．8 讨论和展望

第五章 Cdk5磷酸化BAG3及其在神经突触功能的研究

5．1 BAG3是Cdk5的一个全新底物

5．2 BAG3通过BAG结构域与p25相互作用

5．3 BAG3的亚细胞定位

5．4 AAV2／8-shbag3病毒注射新生鼠的动物模型建立

5．5 敲低BAG3减少神经元树突棘数目和神经元分支

5．6 AAV-shbag3小鼠表现出空间学习记忆受损

5．6．1 AAV-shbag3小鼠在学习记忆相关行为表现较差

5．6．2 AAV-shbag3小鼠的焦虑抑郁等情绪相关行为无变化

5．7 敲低BAG3损害神经突触功能

5．7．1 下调BAG3降低了突触功能相关蛋白水平的表达

5．7．2 在体外神经元中降低BAG3显著下调了Synaptophysin和Synapsin1

5．8 BAG3与突触功能相关蛋白的相互作用的初步探究

5．9 敲低BAG3影响树突棘的形成

5．10 讨论与展望

第六章 小结

参考文献

致谢

在学期间发表的学术论文