牛膝总皂苷保护软骨细胞作用及其机制研究

摘要

骨关节炎(osteoarthritis,OA)是一种以关节软骨退行性病变为主要特征的慢性骨关节病。目前临床应用的非甾体抗炎药有引起胃肠道不良反应及破坏软骨细胞的弊端。中医药治疗OA类疾病历史悠久,实践基础丰厚,不良反应少,因此可深入挖掘中医药治疗的特色与优势。传统中药牛膝为苋科植物牛膝(Achyranthes bidentata Bl.)的根,是中医临床上治疗OA的常用药,具有补肝肾、强筋骨、逐瘀通经、引血下行功效。皂苷类成分是牛膝中重要活性物质,本课题考察了牛膝总皂苷(Achyranthes bidentata Bl. saponins,ABS)对白介素-1β(IL-1β)和碘乙酸钠(MIA)引起的大鼠软骨细胞损伤的影响。
　　牛膝饮片经75％乙醇回流提取,正丁醇萃取,D101大孔吸附树脂富集收集50%乙醇洗脱液,减压浓缩,得到ABS提取物。对ABS含量测定的5种显色方法的考察结果表明:以5%香草醛-冰乙酸:高氯酸:冰乙酸(2:8:50)为最佳测定方法,峰型、加样回收率均优于其它方法。测得ABS含量为52.45%。
　　Ⅱ型胶原酶消化大鼠软骨,获得软骨细胞。加入(终浓度10 ng/mL)IL-1β,可见大鼠软骨细胞活力下降,而3、10、30μg/mL终浓度的ABS能剂量依赖性提高细胞活力。Hochest33258及Annexin V-FITC/PI流式双染细胞术检测显示, ABS对IL-1β所致软骨细胞凋亡有一定的抑制作用。对于IL-1β诱导的抗凋亡蛋白Bcl-xL表达降低和凋亡蛋白Bax、Bad表达上升,ABS有显著抑制作用。对于IL-1β引起的caspase3活性的上升,ABS有显著抑制作用。ABS还可下调IL-1β引起的基质金属蛋白酶(MMP3,MMP9)和环氧化合酶(COX-2)的表达,抑制p53蛋白的磷酸化,并促进细胞增殖抗原(PCNA)的表达。对于IL-1β诱导的NF-κB信号通路活化,ABS能抑制p65亚基的磷酸化,抑制IκBα的降解和磷酸化。
　　200±20 g雄性SD大鼠36只,随机分为6组:正常对照组、模型组、ABS(50,100,200 mg/kg)三个剂量组、硫酸氨基葡萄糖(75 mg/kg)阳性对照组。除对照组外,其余各组大鼠右肢膝关节腔注射MIA(1 mg),各组大鼠灌胃给药或对照液,观测大鼠关节肿胀情况。造模后第28天,各组大鼠断头取血,分离膝关节软骨标本。结果ABS(100,200mg/kg)可显著抑制实验性OA大鼠关节肿胀,降低血清 IL-1β与一氧化氮(NO)水平,抑制软骨胶原蛋白和蛋白多糖的降解。
　　上述结果表明,ABS可通过抑制NF-κB信号通路来保护IL-1β引起的软骨细胞凋亡与炎症损伤;ABS对大鼠实验性 OA有显著治疗作用,其机制可能与抗炎及软骨保护作用有关。本研究可为今后进一步研制开发抗OA中药新药提供前期基础。

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主要符号对照表

第1章 前言

1.1 课题的立题依据及意义

1.2 牛膝药理作用研究进展

1.3 研究思路与论文结构

第2章 牛膝总皂苷的制备及含量测定

2.1 引言

2.2 实验材料

2.3 实验方法

2.4 实验结果

2.5 讨论

第3章 牛膝总皂苷对大鼠软骨细胞的保护作用

3.1 引言

3.2 实验材料

3.3 实验方法

3.4 实验结果

3.5 讨论

第4章 牛膝总皂苷对大鼠实验性骨关节炎的治疗作用

4.1 引言

4.2 实验材料

4.3 实验方法

4.4 实验结果

4.5 讨论

总结与展望

创新点

参考文献

致谢

个人简历、在学期间发表的学术论文及研究进展