酵母葡萄糖耐量因子调控VHG乙醇发酵及GTF结构初步研究

摘要

超高浓度(very high gravity, VHG)乙醇发酵可明显提高发酵终点乙醇浓度,从而可在后续精馏等下游工序中减少大量能耗。由于能耗约占燃料乙醇生产成本的30％,因此,开发节能生产技术可能是现阶段降低生产成本较为切实可行的措施。然而,由于VHG工艺起始葡萄糖浓度高,酵母细胞受到高渗透压、高浓度产物、营养匮乏等诸多因素的协同抑制,导致了菌体生长和存活率都下降,从而降低发酵活性。因此,在VHG乙醇发酵条件下,提高酵母的抗胁迫能力,对改善发酵状况至关重要。本研究考察外源添加所分离纯化的葡萄糖耐量因子(glucose tolerance factor, GTF)对VHG乙醇发酵状况的影响,观察到GTF对VHG乙醇发酵有明显促进作用,进而探索GTF的理化性质及结构。
　　首先,考察了外源添加Cr3+对起始葡萄糖浓度为300 g·L-1的VHG乙醇发酵状况的影响,确定Cr3+的最适添加终浓度为200 mg·L-1,在此条件下,其残糖浓度较对照组(未添加Cr3+)降低了15%,而终点乙醇浓度较对照组(未添加Cr3+)提高了约7%。实验进一步考察了不同时刻添加终浓度为200 mg·L-1Cr3+对VHG乙醇发酵的影响。结果表明,0 h、3 h、6 h任一时刻为起点连续添加Cr3+,均可促进乙醇发酵,其残糖浓度分别为47.7 g·L-1、46.2 g·L-1、43.8 g·L-1,较对照组(55.5 g·L-1)分别降低了14%、17%、21%,而终点乙醇浓度分别为14.6%(v/v)、14.9%(v/v)、15.3%(v/v),较对照组13.9%(v/v)分别提高了5%、7%、10%。因此,最佳 Cr3+添加策略为:添加时刻为发酵6 h,终浓度为200 mg·L-1,在此条件下,发酵36 h的菌体有机铬含量达到55.2μg·gd.m-1,生物量最大,此时的菌体适于后续通过DEAE纤维素柱和Sephadex G-75进行分离纯化GTF。
　　其次,实验进一步在280~320 g·L-1起始葡萄糖浓度条件下,考察外源添加所分离纯化的GTF对VHG乙醇发酵状况的影响。GTF分别在发酵0 h、3 h、6 h添加。结果表明,在起始葡萄糖浓度分别为280、290、310 g·L-1时,在发酵0 h添加GTF均有明显的促进作用,而在起始葡萄糖浓度为320 g·L-1时,在3 h添加GTF有明显的促进作用。即葡萄糖的利用率和乙醇生成均有所促进,其残糖浓度较对照组降低了15%~28%,而终点乙醇浓度较对照组提高了9%~10%,取决于起始葡萄糖浓度(例如:在起始葡萄糖浓度为320 g·L-1时,试验组的残糖浓度为54.4 g·L-1,而终点乙醇浓度为16.7%v/v,分别较对照组降低了19%和提高了约9%)。实验结果提示,可通过外源添加酵母GTF开辟一条促进 VHG乙醇发酵水平的经济可行途径。
　　最后,通过考察分离产物分子量的大小、氨基酸的组成及其红外光谱和紫外-可见光谱特征等初步推断分离产物的化学本质,然后通过生物信息学的方法探索分离产物结构,通过同源建模、分子对接等生物信息学手段对分离产物与己糖转运蛋白家族中的几种与葡萄糖转运有关的蛋白的关系进行探索,通过分子对接的方法推测GTF最有可能与己糖转运蛋白家族中的hxt2p结合而发挥作用。

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第1章 文献综述

1.1 VHG乙醇发酵

1.2 酵母富集Cr3+及产GTF

1.3 GTF的分离、提取及检测

1.4 GTF结构及功能的研究

1.5 本论文研究的意义和内容

第2章 Cr3+对VHG乙醇发酵的影响及酵母GTF的分离

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.3 结果与讨论

2.4 小结

第3章 酵母GTF对VHG乙醇发酵的影响

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.3 结果与讨论

3.4 小结

第4章 分离产物性质和结构的初步研究

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.3 结果与讨论

4.4 小结

第5章 总结与展望

5.1 结论

5.2 创新点

5.3 工作展望

参考文献

致谢

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果