巨尾桉谷胱甘肽还原酶的克隆及其在低温胁迫下的表达模式分析

摘要

植物在生物或非生物胁迫下，细胞质的铜锌超氧化物歧化酶(Copper/Zincsuperoxide dismutases，简称Cu/Zn SOD，CSD)通过超氧化物歧化酶的铜分子伴侣(Copper chaperone for superoxide dismutase，简称CCS）途径和非依赖CCS激活途径激活从而发挥抗氧化解毒作用。生物细胞内谷胱甘肽还原酶（Glutathione reductase，简称GR）催化氧化型谷胱甘肽转化为还原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)，GSH可能将铜离子运送至SOD并使其激活，该酶可能与植物细胞质CSD的非CCS激活途径相关。
　　本研究通过RT-PCR的方法克隆了长度为1485bp、编码495个氨基酸的巨尾桉谷胱甘肽还原酶（GenBank Accession Number:KU904639)，该酶定位于植物细胞质。构建了pET-EuGR原核表达载体并建立了 GR的原核表达体系：37℃，0.1mM的 IPTG浓度,诱导4h时 GR能够稳定表达。通过GR酶活检测表明转化菌株pET-EuGR的GR活性均高于对照菌株，说明外源基因的原核表达产物具有生物活性。利用荧光定量PCR技术分析巨尾桉中GR的时空表达特性，实验表明巨尾桉植株盆栽苗中，幼叶的GR表达量最大，随植株叶片逐渐衰老，其GR表达量也随之下降；在巨尾桉组培苗中，茎的GR表达量最大，其次是叶，GR在根中表达量最低。
　　为研究GR与CSD1非CCS激活途径的关系，首先对实验室保存的pBI-eSOD转基因植株和pBD-anti-4CL-eCSD1两种转基因巨尾桉进行SOD酶活性测定，结合转基因植株的抗寒性实验结果，筛选出具代表性的转基因巨尾桉植株，利用荧光定量PCR技术研究被筛选出的转基因巨尾桉中GR、CSD1、CCS基因在低温胁迫下的表达量关系。（1）分析常温条件下、低温连续处理36h、48h后，耐寒能力强的植株其EuGR、EuCCS、EuCSD的表达量较高（如P40、P41、P52），耐寒能力弱的植株其EuGR、EuCCS、EuCSD的表达量较低（如P36、F44、F76），说明转基因植株的GR、CCS、CSD的表达量影响植株的抗寒能力。（2）连续低温处理后，CSD在低温下表达量先上升后下降，CCS在低温下表达量先下降后上升，GR在低温下表达量持续下降，其中抗寒性强的植株中EuCSD增加量、EuCCS变化量均异常显著，说明CCS、CSD与植物耐寒能力有关，但不足以证明其与寒害后转基因植株的恢复能力相关。（3）结合转基因植株SOD活性分析GR与CSD1激活途径的关联性时发现，CSD1的确能够作为抗寒因子缓解低温胁迫对植物带来的伤害，而CCS在低温处理后伴随SOD酶活力的恢复也逐渐恢复，验证了CCS与CSD的激活密切相关。（4）对于除P36植株（变化异常且抗寒能力及寒害恢复能力均弱）外的所有转基因植株而言，低温的连续处理后GR基因表达量持续下降，在4℃处理36h时其表达量显著高于CCS，初步判断GR与植物的抗寒性相关，且在低温胁迫下与其他作用因子共同参与的CSD1的非CCS激活途径可能占主导地位。

目录

声明

第1章 引言

1.1 铜离子转运载体因子

1.2 GR研究进展

1.3 本论文研究意义及课题来源

第2章 巨尾桉GR基因的克隆

2.1 材料

2.2 实验方法

2.3 结果分析

第3章 建立巨尾桉GR基因的原核表达体系

3.1 材料

3.2 实验方法

3.3 结果分析

3.4 讨论

第4章 GR在巨尾桉中的表达研究

4.1 材料

4.2 实验方法

4.3 结果分析

4.4 讨论

第5章 GR与CCS、CSD在低温下的表达量关系研究

5.1 材料

5.2 实验方法

5.3 结果分析

5.4 讨论

第6章 结论与展望

6.1 研究结论

6.2 展望

参考文献

致谢

个人简历、在校期间发表的学术论文与研究成果