Calpain2在高密度培养条件下影响乳腺癌细胞浸润能力的机制研究

摘要

目的：观察不同细胞密度培养条件下，乳腺癌细胞的浸润能力；解析高密度培养下，calpain2提高乳腺癌细胞SK-Br-3浸润能力的分子机制。
　　方法：
　　（1）将乳腺癌细胞进行低密度培养（细胞汇合度70％）和高密度培养（细胞汇合度达到100%以后，再培养2 d，细胞培养液酚红指示剂变黄），各取5×105个细胞用transwell基质胶进行侵袭能力的测试;为观察calpain2的作用，将乳腺癌细胞进行低密度（sparse）和高密度（dense）培养，利用calpain2特异性抑制剂10-3 mol/L calpain inhibitor IV处理细胞24 h，各取5×105个细胞用Matrigel基质胶进行侵袭能力的测试；为观察MMP-9和Akt的作用，用MMP-9 siRNA转染细胞，对MMP-9进行基因沉默，及用Akt抑制剂10-7 mol/L MK-2206对Akt的活性处理24 h，取5×105个高密度培养的细胞用Matrigel基质胶进行侵袭能力的测试。（2）用Western blot方法检测不同培养密度下，MMP-2、MMP-9的表达情况；为观察calpain2的作用，用10-3 mol/L calpain inhibitor IV处理细胞24 h，用Western blot方法分别观察calpain2对MMP-2、MMP-9的表达影响；为观察Akt对MMP-9的作用，利用Akt抑制剂10-7 mol/L MK-2206处理细胞24 h，用Western blot方法观察Akt对MMP-9的表达影响；为观察calpain2对p-Akt、Akt和PTEN的作用，用10-3 mol/L calpain inhibitor IV处理细胞24 h，用Western blot方法观察calpain2对p-Akt、Akt和PTEN的表达影响。
　　结果：
　　(1) Matrigel基质胶浸润实验发现，与低密度培养条件相比较，高密度培养的乳腺癌细胞的浸润能力明显提高，约为低密度培养的2.2倍（差异有显著性）。
　　(2)Matrigel基质胶浸润实验发现,calpain inhibitor IV处理可以逆转高密度培养条件下乳腺癌细胞提高的浸润能力（差异有显著性）。
　　（3）Western blot检测发现，相对于低密度培养，高密度培养乳腺癌细胞的MMP-9的表达增高（差异有显著性），用calpain inhibitor IV处理可以逆转高密度培养条件下MMP-9的表达上调（差异有显著性）；而MMP-2的表达不受细胞密度和calpain inhibitor IV处理的影响。
　　（4）Matrigel基质胶浸润实验发现，与模拟转染对照（Mock）和DMSO对照相比较，MMP-9 siRNA、Akt抑制剂MK-2206处理可以抑制高密度培养乳腺癌细胞的浸润能力（差异有显著性）；Western blot检测发现，用Akt抑制剂MK-2206可以逆转高密度培养乳腺癌细胞的MMP-9的表达上调（差异有显著性）。
　　（5） Western blot检测发现，相对于低密度培养，高密度培养乳腺癌细胞的PTEN的表达下调（差异有显著性），用calpain inhibitor IV可以逆转高密度培养条件下乳腺癌细胞PTEN的表达下调（差异有显著性）；细胞密度和calpain inhibitor IV处理不影响Akt的表达（差异无显著性）；然而，相对于低密度培养，高密度培养乳腺癌细胞的p-Akt（S473）的水平增高（差异有显著性），用calpain inhibitor IV处理可以逆转高密度培养条件下乳腺癌细胞p-Akt（S473）的磷酸化水平（差异有显著性）。
　　结论：乳腺癌发生发展到一定程度，当细胞密度较高时，calpain2被激活，使PTEN降解增多，减少PIP3转化为PIP2的程度，从而维持Akt的磷酸化激活状态，上调MMP-9的表达，增强乳腺癌细胞的浸润能力。

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0引言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

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综述： 乳腺癌转移相关蛋白的研究进展

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