正义、反义Id1真核表达载体的构建及胃癌细胞中Id1蛋白对MMP9转录活性的影响

摘要

目的： 1．构建正义、反义Idl真核表达载体，并成功转染胃癌SGC7901细胞系，筛选稳定表达的细胞株。 2．探讨胃癌SGC7901细胞中，Idl对MMP9转录表达的影响。 方法：设计Idl基因两端的引物，高保真酶扩增Idl全长序列。将目的基因插入PCDNA3.1+/Hygro构建正义Idl真核表达载体，插入PCDNA3.1-/Hygro构建反义Idl真核表达载体。脂质体转染法转染胃癌SGC7901细胞系，潮霉素筛选稳定表达的细胞株。Western-Blot鉴定转染后胃癌细胞SGC7901中Idl表达活性的高低，RF-PCR法测定Idl不同表达水平的胃癌细胞中MMP9的转录水平，明胶酶谱法测定MMP9的表达活性。 结果： 1．RT-PCR法获得长约530bp的Idl全长序列，经酶切及测序鉴定正确。成功构建正义、反义Idl真核表达载体。 2．转染胃癌SGC7901细胞系。经过8W潮霉素筛选，获得稳定表达的细胞系。经Western-Blot鉴定，转染正义Idl真核表达载体的细胞系Idl表达水平高于对照组，而转染反义Idl真核表达载体的细胞系Idl表达水平低于对照组。 3．RT-PCR法测定在转染正义、反义Idl真核表达载体、转染空载体的胃癌细胞中MMP9的转录水平。显示转染正义Idl真核表达载体的胃癌细胞，与转染空载体的胃癌细胞中MMP9在转录水平上的表达差别无显著性，而在转染反义Idl真核表达载体的胃癌细胞中，MMP9的表达水平显著降低。明胶酶谱显示不同组的转染细胞中，MMP9的活性差异有显著性。 结论：胃癌细胞中Idl可能是MMP9的重要的上游体调控元件。

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论文说明：英文缩略语

声明

前言

第一部分正义、反义Id1真核表达载体的构建及其对胃癌细胞的转染

材料与方法

结果

小结

第二部分胃癌细胞中Id1与MMP9表达的关系

材料与方法

结果

小结

讨论

参考文献

致谢

综述