乙型肝炎病毒B，C基因型X蛋白在原核系统中的克隆表达与纯化

摘要

目的： 应用分子克隆技术获得乙型肝炎病毒(HBV)B、C基因型X蛋白，为进一步研究X基因在乙型肝炎病毒所致疾病中的作用奠定基础。 方法： ①基因克隆：应用PCR技术，分别从本实验室构建的B、C基因型HBV保守的X基因真核表达重组子—pcDNA3.1-Xb和pcDNA3.1-Xc中获取X全长基因，产物经EeoR I和XhoI酶切，分别与原核表达载体pET-42a连接，转化BL-21感受态细胞，抗生素筛选阳性重组子，PCR、酶切、测序鉴定。 ②蛋白表达纯化：取鉴定后的B，C基因型X基因重组菌，IPTG诱导重组蛋白的表达，SDS-PAGE电泳，用GST抗体经Western Breeze化学发光法鉴定融合蛋白。优化诱导时间和IPTG浓度，诱导重组蛋白大量表达；低温诱导可溶性X蛋白的形成。分别用GST和Ni-NTA bind纯化试剂盒纯化X蛋白，比较两种方法的纯化效果，并用Bradford法测定重组蛋白浓度。 结果： ①PCR法获取的乙型肝炎病毒B、C基因型X基因的大小与预期一致；克隆后筛选的阳性重组子经PCR、酶切、测序鉴定正确。 ②重组子均可被IPTG诱导表达融合蛋白，表达产物可被GST抗体识别：当诱导时间为2 h、IPTG终浓度为0.5 mMol/L时，表达量均达最大，约为菌体总蛋白的40％以上：18℃，25℃，30℃均难以诱导可溶性蛋白的产生；溶解后的包涵体经复性后进行GST纯化，但是最终未能得到目的蛋白；而用Ni-NTA纯化后可直接得到大量融合蛋白，而且纯度可达95％以上。 结论： 成功构建了B、C基因型乙型肝炎病毒X基因的原核表达系统，并获得高效表达：重组蛋白经Ni一柱纯化后可得到大量重组蛋白，且纯度较高，为进一步研究X基因在乙型肝炎病毒所致疾病中的作用奠定基础。

目录

论文说明：英、汉缩略名词对照表

声明

前言

第一部分乙型肝炎病毒B，C基因型X基因片断原核表达重组子的构建

引言

材料和方法

结果

讨论

小结

第二部分B，C基因型乙型肝炎病毒X基因片断的表达及产物纯化

引言

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

综述 乙型肝炎病毒基因分型及其与临床相关性研究进展

致谢