舟山眼镜蛇蛇毒磷脂酶A的分离及其对M型胆碱受体的作用

摘要

蛇毒成分与生物体内的胆碱能系统关系密切。近年来，作用于M胆碱受体的蛇毒成分日益受到重视。有学者从曼巴蛇(Dendroaspis angusticeps)蛇毒分离出一些与M胆碱受体具有高度亲和力的单体成分，并称之为muscarinic toxins(MTs)。MTs对M1和M4受体亚型具有很强的选择性，某些MTs已被作为研究M胆碱受体亚型的工具药加以开发应用；部分MTs还能激动M1胆碱受体，可显著改善动物学习记忆障碍，具有开发成药物的潜力。有学者尝试从曼巴蛇以外蛇种的蛇毒中分离具有M胆碱受体亲和力的成分。Miyoshi和Tu分别从眼镜蛇南洋亚种Naja naja sputatrix和南美响尾蛇Crotalus atrox蛇毒分离获得与M胆碱受体具有极高度亲和力的单体成分，并称之为mAChR inhibitors(MIs)。但是，MIs与M胆碱受体的亲和力远强于D.angusticeps蛇毒中MTS；两种MIs的分子量(分别为13.6 kDa和30kDa)远大于MTs(约7kDa)；而且非常有趣的是MIs具有磷脂酶A2活性，是一种蛇毒磷脂酶A2，MTs则无磷脂酶A2活性。然而，MIs对M胆碱受体的药理作用尚未见文献报道，有待于探索。 蛇毒磷脂酶A2(venom phospholipase A2，vPLA2)在结构和水解功能上与哺乳类动物的分泌型磷脂酶A2(secreted PLA2，sPLA2)非常相似。然而，除了具有与哺乳动物sPLA2相同水解催化活性之外，vPLA2还具有某些重要的药理毒性作用。近年来研究提示，vPLA2的药理毒理作用可能是通过与组织中特定的靶蛋白位点特异结合而产生的。如上所述，MIs是一种vPLA2，与M胆碱受体具有极高的亲和力，因此探索其对M胆碱受体的药理作用甚为必要。 舟山眼镜蛇，也称中华眼镜蛇(Naja atra)在我国华南地区广泛分布，蛇毒资源丰富，其与N.naja sputatrix蛇种相近。鉴此，本研究首先拟采用色谱层析技术从舟山眼镜蛇蛇毒分离纯化获得MIs类的磷脂酶A2；进而运用放射配体受体结合法分析该蛇毒单体成分与M胆碱受体的亲和力以及对M胆碱受体亚型的选择性；接着采用离体器官试验，在M胆碱受体的功能模型上探索该vPLA2的生物学效应以及对M胆碱受体及其亚型的药理作用，为其可能的开发利用(工具药或治疗药物)提供实验依据和理论基础，也有助于加深理解体内sPLA2生理与病理生理作用。本研究主要研究内容包括以下三个部分： 1.舟山眼镜蛇蛇毒磷脂酶A2的分离纯化及其理化性质通过采用一系列色谱层析分离方法(Sephadex G-50和Sephadex G-150凝胶过滤色谱、CM-Sepharose Fast Flow离子交换层析色谱及POROS (R)CM4.6/100预装柱灌注色谱层析)和运用离体生物测定法筛选活性成分，从舟山眼镜蛇粗毒中分离纯化获得一种能引起离体豚鼠回肠纵行肌收缩的活性蛋白成分。初步判断其对M胆碱受体具有激动作用，暂命名为muscarinic protein，简称MP。经SDS-PAGE和HPLC鉴定MP的纯度达到电泳纯和色谱纯水平。质谱分析MP的分子量为13.3 kDa，与vPLA2的分子量相似。Edman降解法测定MP的N端16位氨基酸序列为NLYQFKNMIQCTVPSR，与已发现的眼镜蛇vPLA2的序列一致，与其他蛇种的vPLA2具有很高的同源性。以上两点提示MP很可能是一种vPLA2。通过磷脂酶A2活性测定，验证了这一点。小鼠急性毒性试验显示MP具有致死性，LD50值为14.3mg/kg。 2舟山眼镜蛇蛇毒磷脂酶A2对M型胆碱受体的亲和力采用放射配体受体结合法，分析MP对M型胆碱受体及其亚型的亲和力。结果表明，MP可剂量依赖性地抑制[3H]QNB与大鼠端脑M胆碱受体的结合反应，其IC50值为28.0nmol/L，K1值为10.1nmol/L，提示MP对大鼠端脑M胆碱受体具有高度亲和力，且其亲和力明显大于阿托品和D.angusticeps蛇毒中MT2，与N.naja sputatrix蛇毒中MI相当。 分别选用大鼠大脑皮层和大鼠心肌作为M1和ME受体亚型结合模型，比较MP对这两种受体亚型的选择性。结果表明，MP可完全抑制[3H]QNB与大鼠大脑皮层或大鼠心肌组织的结合，并呈剂量依赖性：MP抑制[3H]QNB与大鼠大脑皮层结合的IC50值为248.8 nmol/L，而抑制[3H]QNB与大鼠心肌结合的IC50值为22.1 nmol/L，提示MP对M2亚型的亲和力可能大于M1亚型。 3舟山眼镜蛇蛇毒磷脂酶A2对M型胆碱受体的药理作用3.1 MP对M胆碱受体的作用通过观察MP在离体豚鼠回肠纵行肌上的效应，研究MP对M胆碱受体的作用。结果显示，MP在豚鼠回肠纵行肌标本上可产生剂量依赖性的收缩效应，与CCh相似，且该效应可被阿托品(2 μmol/L，以上浓度)所拮抗。MP效应的EC50值为29.5nmol/L，与CCh(48nmol/L)比较接近，但MP在豚鼠回肠纵行肌标本上的最大收缩效应约为CCh的43％。提示MP可能对M胆碱受体具有部分激动作用。但是，阿托品阻断MP的浓度明显大于阻断CCh所需的浓度，且高浓度阿托品(0.3和3 μmol/L)只能减小MP的最大效应，无法使MP的量效曲线平行右移，提示阿托品并不是简单地竞争拮抗MP对M胆碱受体的作用。 本试验还从神经节、结合位点及.ACh的释放等MP有可能作用的几个环节研究MP在豚鼠回肠上的作用机制。六烃季铵(100μmoI/L)对MP在豚鼠回肠纵行肌标本上的收缩作用无明显影响，提示MP在豚鼠回肠纵行肌标本上的作用部位不在上游的神经节，而在效应器上。MP(6μmol/L)不影响CCh的量效曲线，提示MP与CCh不是作用于同一位点。MP对豚鼠回肠纵行肌的作用液可引起蛙腹直肌收缩，提示促进ACh的释放可能与MP收缩豚鼠回肠作用有关。 本试验还通过观察磷脂酶A2抑制剂DEDA和温度对MP在豚鼠回肠纵行肌上作用的影响，来了解MP对豚鼠回肠纵行肌的作用与其磷脂酶A2活性的关系。DEDA(100μmol/L)对MP对豚鼠回肠纵行肌作用的量效曲线无明显影响。27℃和37℃两种温度条件下，磷脂酶A2的活性差异较大，而MP对豚鼠回肠纵行肌的收缩作用无明显差异。以上两点提示MP引起豚鼠回肠纵行肌的收缩效应可能不依赖其磷脂酶活性。 3.2 MP对M1和M2受体的作用与McN-A-343的作用相似，MP几乎完全抑制电刺激兔输精管收缩，作用呈剂量依赖性。MP抑制作用的EC50值约为23.7 nmol/L，约为McN-A-343(300 nmol/L)的1/13。提示MP作用的效能与McN-A-343相当，效价为McN-A-343的十几倍。哌仑西平(0.1μmol/L)可使MP量效曲线平行右移，最大效应不变。提示MP抑制电刺激兔输精管收缩是由M1受体介导的，MP对M1受体具有激动作用。 低剂量MP(2×10-10～2×10-75mol/L)轻微抑制豚鼠心房肌的自律收缩(与CCh相似)，作用只有CCh的20％；丽高剂量MP(2×10-7～2×10-5.5～mol/L)增强豚鼠心房肌的自发收缩(与阿托品相似)，提示MP可能是M2受体较弱的部分激动剂。 3.3蜂毒磷脂酶A2及猪胰磷脂酶A2对豚鼠回肠纵行肌的作用观察蜂毒磷脂酶A2和猪胰磷脂酶A2在豚鼠回肠纵行肌的效应，了解MP对M胆碱受体的药理作用是否磷脂酶A2的一个共性。 蜂毒磷脂酶A2剂量依赖性收缩豚鼠回肠纵行肌，且可被阿托品(10-6mol/L)部分阻断，其效应的EC50值(24.1nmol/L)，与MP的EC50值(29.5nmol/L)较为接近，为CCh的EC50值(48nmol/L)的1/2，最大效应为CCh的50％左右。猪胰磷脂酶A2剂量依赖性地收缩豚鼠回肠纵行肌，且可被阿托品(10-6mol/L)部分阻断，最大效应为CCh的40％左右。以上结果显示，这两种磷脂酶A2对豚鼠回肠纵行肌的作用与MP相似，提示MP对M胆碱受体的作用可能是磷脂酶A2的一个共性。 综上所述，本研究表明： 1.从舟山眼镜蛇蛇毒分离纯化获得一种蛇毒磷脂酶A2单体成分，暂命名为muscarinic protein(MP)，其纯度达色谱纯，分子量为13.3 kDa，N端16个氨基酸序列为NLYQFKNMIQCTVPSR，具有磷脂酶A2活性。 2.MP对M胆碱受体具有高度亲和力，其K1值为10.1nmol/L，亲和力明显大于阿托品和Dendroaspis angusticeps蛇毒中MTs，与Naja najasputatrix蛇毒中MI相当。MP对M2受体亚型的亲和力大于M1受体亚型，可能具有一定的亚型选择性。 3.MP可激动M胆碱受体，对M1受体可能具有较强的激动作用，而对M2受体的激动作用很弱。 4.MP可致豚鼠回肠平滑肌收缩，其作用机制可能与MP激动M胆碱受体以及促进乙酰胆碱释放有关，但与MP磷脂酶A2活性可能无关。

目录

论文说明：英文缩略字表

声明

前言

第一部分舟山眼镜蛇蛇毒磷脂酶A2的分离纯化及其理化性质

1材料

2方法

2.1柱层析色谱分离

2.2蛇毒分离组分的活性鉴定

2.3蛋白纯度鉴定

2.4蛋白分子量测定

2.5N端氨基酸序列分析

2.6磷脂酶A2活性测定

2.7小鼠急性毒性试验

3结果

3.1活性组分MP的分离与纯化

3.2MP的理化性质

3.3MP的磷脂酶A2活性

3.4MP对小鼠急性毒性

4讨论

5小结

第二部分舟山眼镜蛇蛇毒磷脂酶A2与M型胆碱受体的亲和力

1材料

2方法

2.1放射配体受体结合法

3结果

3.1放射配体[3H]QNB与M胆碱受体结合的特性

3.2 MP抑制[3H]QNB与大鼠端脑M胆碱受体的结合

3.3MP对M1和M2两个M胆碱受体亚型的亲和力比较

4讨论

5小结

第三部分舟山眼镜蛇蛇毒磷脂酶A2对M型胆碱受体的药理作用

1材料

2方法

2.1离体豚鼠回肠纵行肌试验

2.2离体豚鼠心房肌试验

2.3电刺激离体兔输精管试验

2.4离体蛙腹直肌试验

3结果

3.1MP对M胆碱受体的作用

3.2MP对M1和M2受体的作用

3.3蜂毒磷脂酶A2及猪胰磷脂酶A2对豚鼠回肠纵行肌的作用

4讨论

5小结

结论

参考文献

附录

致谢

综述：蛇毒磷脂酶A2的结构、功能及作用机制