舟山眼镜蛇毒细胞毒素CTXn的分离纯化及其镇痛作用研究

摘要

背景：蛇毒是由多种蛋白质、多肽、酶类和其他小分子物质组成的混合物。细胞毒素（cytotoxins，CTXs）和神经毒素(neurotoxin，NT)和PLA2是其主要毒性成分。细胞毒素由60--63个氨基酸组成，空间结构呈三指结构，因其分子中由致密的内核伸展出3个指状肽链环而得名。蛇毒的成分复杂多样，种属之间变异很大。同一种属，由于性别、年龄、或地域的不同，成分也会有所差别.Mukherjee AK[6]研究发现，印度相邻三个地区的同种眼镜蛇毒，排除年龄，性别，季节的影响，其成分和生物活性仍存在很大差别。舟山眼镜蛇主要分布于华南，台湾、越南北部和老挝北部地区，明确其成分的地域性差异，对蛇毒的分离纯化和蛇伤急救有实际应用价值。
　　 神经病理性疼痛常由外周或中枢的神经损伤或功能紊乱引起。临床主要表现为：痛反应增强（hyperalgesia)、痛阈下降(allodynia)和自发性疼痛(spontaneous pain)。目前临床上对神经病理性疼痛还缺乏有效的药物治疗，常用的镇痛药物主要是NSAIDs和阿片类药物，但药效的局限和不可避免的副作用限制了其应用。因此，有必要寻找和开发新的有效减缓神经病理性疼痛的药物。外周神经损伤的动物模型如，SNI,CCI,SNL等，能够模拟神经病理性疼痛的一些症状，对研究神经病理性疼痛的机制和药物开发提供了工具和载体。
　　 蛇毒镇痛的研究与应用已有很久的历史。在上世纪初，已有报道从眼镜蛇毒中分离出的神经毒素cobrotoxin具有镇痛作用。从响尾蛇毒中分离出的crotalphine，通过κ-opioid受体，对CCI模型引起的痛敏，痛超敏和自发痛具有抑制作用。从响尾蛇毒中分离出的crotoxin，通过中枢烟碱受体和5-HT受体，对坐骨神经瘤疼痛模型引起的神经病理性疼痛具有镇痛作用。细胞毒素的作用，则主要集中在心脏毒性，细胞凋亡，抗肿瘤，细胞毒性和抗血小板聚集。近期Dexian Donga和Jiang WJ报道了细胞毒素的镇痛作用。相对于神经毒素，细胞毒素由于其低毒性，显示了广阔的应用前景。研究细胞毒素的镇痛及其作用机制已成为蛇毒镇痛研究的新的方向。本实验拟探讨蛇毒细胞毒素CTXn的镇痛作用，为镇痛药物开发提供实验支持。
　　 目的：运用RP-HPLC比较大陆中南地区六省区的舟山眼镜蛇毒的成分差异，选取CTX含量丰富的江西宜春地区的舟山眼镜蛇蛇毒进行分离纯化和镇痛组分初筛。经过生化鉴定后，运用急性疼痛模型和神经病理性疼痛模型进行镇痛作用的评价，同时运用微透析联合RP-HPLC技术对其镇痛作用机制作一初步探讨。
　　 方法：
　　 一、舟山眼镜蛇毒细胞毒素的分离纯化及鉴定
　　 1.中南地区蛇毒样品的RP-HPLC分析
　　 收集中南地区六个省区的舟山眼镜蛇毒样本，经采集处理后，运用RP-HPLC技术进行蛇毒成分的含量的地域性差异分析。
　　 2.舟山眼镜蛇毒的分离纯化及成分鉴定
　　 舟山眼镜蛇蛇毒的分离纯化采用Sephadex G-75层析和离子交换层析两步法进行。将分离后的蛇毒各组分进行镇痛作用初筛。选取有效成分作进一步纯度分析和MALDI-TOF质谱及蛋白质序列测定。
　　 二．CTXn的毒性及镇痛活性测定
　　 1.毒理学实验
　　 Bliss法检测其LD50毒性，运用药物耐受性模型、间接 ELISA 检测和条件性位置偏爱(CPP）实验、大鼠催促戒断实验和自然戒断实验测定CTXn的药物耐受性和依赖性。
　　 2.急性疼痛实验
　　 运用热板实验和醋酸扭体实验测定CTXn对生理性疼痛的镇痛作用。
　　 3.神经病理性疼痛实验
　　 运用大鼠脊神经结扎(SNL)模型测定CTXn对机械刺激痛敏和热刺激痛敏的抑制作用；并用非特异性阿片受体拮抗剂纳洛酮和胆碱能受体拮抗剂阿托品测定其对CTXn镇痛作用的影响。
　　 4.动物自主活动测试旷场实验
　　 检测CTXn对动物自主活动的影响。
　　 三．微透析技术检测CTXn对脊髓水平单胺类神经递质的调控
　　 1.采用脊髓微透析技术联合HPLC-ECD技术
　　 实时动态采集脊髓背角部位的单胺类神经递质去甲肾上腺素(NA)和5-羟色胺（5-HT）进行定量分析，测定其NA和5-HT的含量变化及CTXn对其含量的影响。
　　 2.测定纳洛酮和阿托品干预对CTXn引起NA和5-HT含量变化的影响。
　　 四．统计分析
　　 采用t检验、χ2检验，SPSS软件等统计分析实验数据。
　　 结果：
　　 1.运用RP-HPLC比较中南六省区的舟山眼镜蛇毒成分差别，结果发现各地蛇毒样品中所含主要成分相同，但各成分的含量存在很大差异。CTXn在江西宜春地区的含量最高，在广西元宝山地区则没有发现这种成分。
　　 2.运用Sephadex G-75层析和离子交换层析两步法对舟山眼镜蛇蛇毒进行分离纯化。分离效果良好，分离组分的纯度可达95％以上。
　　 3.蛇毒成分的镇痛初筛和理化性质鉴定结果发现，所分离出的成分中，CTXn的镇痛效果较好，治疗指数高。
　　 4.CTXn的小鼠腹腔注射的LD50为19.61±2.05mg/kg.CTXn长期腹腔给药易导致药物耐受，腹腔给药期间ELISA检测有抗体产生。CTXn鞘内给药不存在药物耐受。条件性位置偏爱(CPP）实验、大鼠催促戒断实验和自然戒断实验结果说明长期给予CTXn不会产生药物依赖性。
　　 5.热板实验和醋酸扭体实验测定，不同剂量的CTXn(0.50mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg.ip.)对生理性疼痛有良好镇痛作用，且具剂量依赖性。
　　 6.神经病理性疼痛实验测定，CTXn（0.50mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg.ip.）对SNL引起的机械刺激痛敏和热刺激痛敏有抑制作用；其镇痛作用可被纳洛酮翻转，但阿托品对此无影响。
　　 7.旷场实验检测，结果表明实验剂量的CTXn对动物自主活动无影响。
　　 8.脊髓微透析联合HPLC-ECD技术检测发现，CTXn可促进SNL模型动物脊髓背角去甲肾上腺素(NA)和5-羟色胺（5-HT）的分泌增加。纳洛酮可逆转此作用。
　　 结论：
　　 1.中南六省区的舟山眼镜蛇毒成分存在地域性差异。地域相近的蛇毒成分含量较为接近。
　　 2.运用Sephadex G-75层析和离子交换层析两步法分离纯化眼镜蛇蛇毒，分离效果好，纯度高。
　　 3.CTXn长期系统给药，易导致药物耐受，可能与抗体的产生及中和作用有关。CTXn长期应用不会产生依赖性。
　　 4.CTXn对生理性疼痛和神经病理性疼痛模型都有镇痛作用；中枢阿片系统参与其镇痛作用，其作用可能是通过激活阿片系统，进一步诱导脑干下行抑制系统的NA和5-HT神经递质释放到脊髓背角，从而发挥镇痛作用。胆碱能系统对此无影响。