MyD88在OK-432诱导树突状细胞成熟中的作用

摘要

目的：本课题旨在应用RNAi(RNA interference)技术探讨小鼠骨髓树突状细胞(dendritic cells，DCs)髓性分化因子88(Myeloid differentiation factor88，MyD88)在OK-432诱导的DCs成熟中作用机制，为DCs成熟机制提供新的研究切入点。
　　 方法：采用贴壁粘附法分离小鼠骨髓单个核细胞，并在含10％胎牛血清(FCS)、重组小鼠粒-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)、重组小鼠白细胞介素-4(rmIL-4)的培养体系中诱导培养，以OK-432作为DCs的成熟刺激因子。将实验分为3组：空白对照组不加任何药物,OK-432组加入终浓度为5μg/ml的OK-432，RNA干扰组加入MyD88 siRNA12小时后再加入5μg/ml OK-432刺激。倒置显微镜和瑞氏-姬姆萨(Wright-Giemsa)染色观察细胞形态；流式细胞仪检测DCs表面抗原CD83的表达情况；半定量RT-PCR法检测DCs中MyD88及NF-κB mRNA的表达；ELISA法检测各组DCs分泌IL-12和TNF-α的浓度；并用MTT法检测DCs体外刺激同种混合淋巴细胞增殖的免疫活性和DCs诱导的CTL对小鼠前胃癌细胞的细胞毒作用。
　　 结果：
　　 1小鼠骨髓单核细胞在含10％FCS、rmGM-CSF和rmIL-4的培养体系中培养至第七天即分化成形态正常的未成熟DCs(Immature DCs，imDCs)，加入OK-432后其形态具备成熟的特征，而用MyD88 siRNA干扰后，则抑制了DCs的成熟。
　　 2培养第七天的DCs表面抗原CD83测定结果示，OK-432组CD83表达率(13.17±0.93)比空白组(3.00±0.44)明显上调，而RNA干扰组(5.97±0.59)与OK-432组相比则显著降低，差异均具有统计学意义(P＜0.01)。
　　 3 DCs中MyD88及NF-κB mRNA的表达测定结果示，OK-432组高于空白组和RNA干扰组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　 4 DCs上清液中细胞因子IL-12和TNF-α浓度测定结果显示，OK-432组DCs分泌的细胞因子浓度(IL-12：76.53±7.60 pg/ml，TNF-α：109.49±17.73 pg/ml)明显高于空白组(IL-12：23.41±5.14 pg/ml，TNF-α：40.71±8.19 pg/ml)，加入MyD88 siRNA之后，DCs所分泌的细胞因子(IL-12：30.09±4.98 pg/ml，TNF-α:49.80±5.57 pg/ml)显著减少，差异均有统计学意义(P＜0.01)。
　　 5 DCs刺激混合淋巴细胞增殖反应及诱导的CTL对前胃癌细胞株的细胞毒作用均显示，OK-432组明显高于空白组，而RNA干扰组则低于OK-432组，均具有统计学意义(P＜0.05)。
　　 结论：
　　 1 OK-432促使DCs中MyD88及NF-κB高表达、TNF-α和IL-12释放明显增加并能诱导较强混合淋巴细胞增殖反应及CTL对前胃癌细胞强烈的杀伤效应。
　　 2靶向MyD88 siRNA则可明显抑制小鼠骨髓性DCs中MyD88 mRNA的表达，并抑制了OK-432诱导的DCs成熟，由此证明MyD88介导OK-432诱导的DCs成熟。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略词表

声明

前言

第一部分 MyD88 siRNA转染小鼠骨髓树突状细胞及其形态学和表型鉴定

材料与方法

结果

讨论

第二部分 树突状细胞中MyD88及NF-κB mRNA的表达及其分泌细胞因子的测定

材料与方法

结果

讨论

第三部分 树突状细胞刺激淋巴细胞增殖功能测定以及体外的细胞毒作用

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

致谢

综述 TLRs/MyD88信号转导通路与树突状细胞的研究进展