胶原-壳聚糖/胶原-纳米羟基磷灰石仿生支架复合BMSCs体外构建组织工程骨软骨的前期实验研究

摘要

【目的】1．分离、培养扩增和鉴定猪BMSCs。2．构建TGF-β1重组慢病毒表达载体，并转染BMSCs，为骨软骨组织工程修复提供持续高效的种子细胞。3.制备胶原-壳聚糖/胶原-纳米羟基磷灰石支架材料并检测其生物相容性。
　　 【方法】1．分离、培养扩增和鉴定猪BMSCs：联合应用密度梯度离心法及贴壁培养法分离、培养扩增猪BMSCs，并应用流式细胞仪鉴定BMSCs表面相对特异性分子(CD90、CD105、CD45）的阳性率以明确BMSCs的纯度。2．构建TGF-β1重组慢病毒表达载体，并转染BMSCs：将已提取的目的基因TGF-β1cDNA包装至慢病毒载体中，通过PCR及基因测序对阳性克隆进行鉴定，并用Real-time PCR检测慢病毒滴度；利用TGF-β1重组慢病毒转染BMSCs，通过Western blot、RT-PCR，免疫细胞化学、Elisa等方法检测TGF-β1基因及蛋白在BMSCs中的表达情况，以明确转染效果。3. 制备胶原-壳聚糖/胶原-纳米羟基磷灰石支架材料并检测其生物相容性：由清华大学研发和制备出胶原-壳聚糖/胶原-纳米羟基磷灰石支架材料，并依据相关标准选择急性全身毒性试验、皮内刺激试验、热原试验、溶血试验、体外细胞毒性试验及骨植入试验检测胶原-壳聚糖/胶原-纳米羟基磷灰石支架材料的生物相容性。
　　 【结果】1.联合应用密度梯度离心法及贴壁培养法成功分离、培养扩增猪BMSCs，流式细胞仪检测细胞表面相对特异性分子的阳性表达率显示：CD90为91.2％，CD105为93.5％，CD45为4.4％。2.经PCR及基因测序鉴定TGF-β1重组慢病毒表达载体构建成功，测定滴度为2×109TU/ml；以慢病毒为载体，将TGF-β1基因导入猪BMSCs，经Western blot、RT-PCR、免疫细胞化学及Elisa提示TGF-β1基因成功导入BMSCs，并表达TGF-β1蛋白。3. 胶原-壳聚糖/胶原-纳米羟基磷灰石支架材料的急性全身毒性试验、皮内刺激试验、热原试验、溶血试验、体外细胞毒性试验均符合相关标准，骨植入试验显示支架材料与周边组织相容性好。
　　 【结论】1.联合应用密度梯度离心法及贴壁培养法可以获取纯度较高的猪BMSCs。2.成功构建TGF-β1重组慢病毒表达载体，并成功转染BMSCs，TGF-β1基因可长期、稳定表达。3.成功制备出生物相容性良好的胶原-壳聚糖/胶原-纳米羟基磷灰石支架材料。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一部分猪骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定

第二部分构建TGF-β1过表达慢病毒载体并转染BMSCs

第三部分胶原-壳聚糖/胶原-纳米羟基磷灰石支架的制备

全文总结

参考文献

致谢

基因修饰的骨髓间充质干细胞在修复关节软骨损伤中的应用