基因修饰的BMSCs复合胶原-壳聚糖/胶原-纳米羟基磷灰石仿生支架体内构建组织工程骨软骨的研究

摘要

目的:
　　探讨TGF-β1和BMP-2基因修饰的骨髓间充质干细胞（BMSCs）复合新型仿生支架材料胶原-壳聚糖/胶原-纳米羟基磷灰石修复关节软骨和软骨下骨损伤的可行性，为组织工程化骨软骨的临床应用提供实验依据。
　　方法:
　　联合应用密度梯度离心法及贴壁培养法分离、培养、纯化猪BMSCs，应用TGF-β1和BMP-2重组慢病毒转染的BMSCs，荧光显微镜观察转染率；将转染后细胞分层复合到胶原-壳聚糖/胶原-纳米羟基磷灰石支架（Col-CS/nHAC-PLA）材料上，扫描电子显微镜（SEM）检测支架的孔隙率、孔径和BMSCs在支架上的粘附生长情况，制作猪股骨髁骨软骨损伤的动物模型，并应用复合TGF-β1和BMP-2基因修饰的BMSCs的支架进行修复。分别在12W、24W取材，观察修复组织的大体情况、苏木精-伊红染色、碱性磷酸酶染色、阿尔新蓝过碘酸雪夫染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色情况，评价软骨和软骨下骨损伤的修复情况。
　　结果:
　　1、联合应用密度梯度离心法和贴壁培养法可以成功分离、培养、纯化猪BMSCs，TGF-β1和BMP-2重组慢病毒可成功转染的BMSCs，荧光显微镜下观察到荧光蛋白表达，间接反映TGF-β1和BMP-2蛋白的表达。
　　2、Col-CS/nHAC-PLA经SEM检测，其孔隙率都达到80％左右，CS孔径约为30-100μm之间，HA孔径约为50-120μm之间，符合BMSCs生长所需微环境，SEM还观察到BMSCs在支架上粘附生长的情况。
　　3、成功制作猪膝关节骨软骨损伤动物模型，并应用组织工程骨软骨进行修复。12W时，大体及组织学观察示细胞复合组新生软骨较单纯材料组厚且表面较平整，新生软骨和软骨下骨连续性好，成骨细胞胞浆中棕色的碱性磷酸酶颗粒较多，新生软骨基质连续性好，染成棕色的Ⅱ型胶原明显。24W时，大体及组织学观察示细胞复合组较单纯材料组新生软骨完整且较透明，新生软骨和软骨下骨连续性好且排列规则，成骨细胞及胞浆中棕色的碱性磷酸酶颗粒多，新生软骨基质连续性好且排列规则，染成棕色的Ⅱ型胶原明显。
　　4、将修复的组织作为一个整体，进行O'Driscoll，Keeley and Salter组织形态学评分。统计提示实验组在12周和24周时修复骨软骨缺损后的评分要优于对照组(p<0.05)。
　　结论:
　　基因修饰的BMSCs复合胶原-壳聚糖/胶原-纳米羟基磷灰石仿生支架能够有效修复软骨和软骨下骨的复合损伤，为治疗关节骨软骨损伤提供了新的思路。

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中文摘要

英文摘要

英文缩略词表

前言

材料与方法

1. 实验材料

1.1、实验动物

1.2、主要试剂和仪器

2、实验方法

2.1、猪BMSCs的分离、培养和纯化

2.2、猪BMSCs的鉴定

2.3、TGF-β1和BMP-2慢病毒转染BMSCs

2.4、Col-CS/nHAC-PLA的孔隙率和孔径测定。

2.5、BMSCs复合支架后细胞粘附生长情况观察

2.6、构建组织工程骨软骨的体内试验

2.7、术后修复情况观察

2.8、修复组织的组织学检查

2.9、O'Driscoll，Keeley and Salter组织形态学评分

结果

1、猪BMSCs培养和鉴定

2、TGF-β1和BMP-2过表达慢病毒转染BMSCs

3、新型仿软骨-软骨下骨结构的胶原-壳聚糖/胶原-纳米羟基磷灰石支架的材料特性

3.1、大体观察。

3.2、新型仿生支架材料的孔隙率和孔径

3.3、BMSCs复合支架后细胞粘附生长情况

4、修复组织的大体观察

5、修复组织的组织学观察

5.1、HE染色

5.2、碱性磷酸酶染色

5.3、阿尔新蓝过碘酸雪夫染色

5.4、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色

6、统计学处理

讨论

结论

参考文献

致谢

综述

参考文献